[发明专利]用于RNA定向的靶DNA修饰和用于RNA定向的转录调节的方法和组合物

权利要求书

1.一种修饰靶DNA的方法，所述方法包括使所述靶DNA与复合物接触，所述复合物包含：

(a) Cas9多肽，以及

(b) 单分子靶向DNA的RNA，其包含：

(i) DNA靶向区段，其包含与所述靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；和

(ii) 蛋白质结合区段，其与所述Cas9多肽相互作用，其中所述蛋白质结合区段包含杂交以形成双链RNA(dsRNA)双链体的两个互补核苷酸段，

其中所述dsRNA双链体包含tracrRNA和CRISPR RNA（crRNA）的互补核苷酸，

其中所述两个互补核苷酸段是通过插入核苷酸共价连接，

其中所述接触为体外的或在离体细胞内；以及

其中所述修饰为裂解所述靶DNA。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述dsRNA双链体的长度为8个碱基对(bp)至30 bp。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质结合区段的杂交以形成dsRNA双链体的核苷酸之间的互补百分比为70%以上。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质结合区段的杂交以形成dsRNA双链体的核苷酸之间的互补百分比为70%以上。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA存在于细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物、植物细胞、无脊椎动物细胞或脊椎动物细胞中。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA为染色体DNA。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述接触包括将以下引入细胞：(a) 所述Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b) 所述靶向DNA的RNA或编码所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述接触包括将以下引入细胞：(a) 所述Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b) 所述靶向DNA的RNA或编码所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述接触包括将以下引入细胞：(a) 所述Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b) 所述靶向DNA的RNA或编码所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中。

13.如权利要求1-4和8-12中任一项所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。

14.如权利要求5所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。

15.如权利要求6所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。

16.如权利要求7所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。

17.如权利要求1-4和8-12中任一项所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。

18.如权利要求5所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。

19.如权利要求6所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。