[发明专利]定量多重甲基化特异性PCR方法-cMethDNA、试剂及其用途

说明书

相关申请的引用

本申请要求2012年5月22日提交的美国临时专利申请号61/650,083的权益，该美国临时专利申请在此通过引用并入本文用于所有目的，如同在本文中充分阐明。

通过引用并入的电子提交的材料

本申请包含经EFS-Web以ASCII格式提交并在此通过引用以其整体并入的序列表。所述ASCII文本，创建日期为2013年5月13日，名称为P12014-02_SL.txt且大小为58,416字节。

技术领域

本发明涉及定量多重甲基化特异性PCR方法-cMethDNA、试剂及其用途。

背景技术

现在清楚的是，包括基因启动子和基因内部一些区域的过度甲基化的表观遗传改变与肿瘤进展一致且是其中的早期事件。认为此类改变通过转录沉默肿瘤抑制基因表达并通过增加基因突变的比率有助于肿瘤过程。由于DNA甲基化不改变DNA序列，其是可逆的；然而，其是从细胞至细胞可遗传的。如此，甲基化的基因可用作生物标志物诸如用于癌症的早期检测、风险评估、预测并监测对治疗的反应、以及复发的早期检测。

肿瘤DNA可见于各种体液，并且这些体液可潜在地用作诊断材料。肿瘤DNA在这些液体中的评价需要特异以及敏感的方法。已知称为甲基化特异性PCR(MSP)的基于PCR的技术在一千个未甲基化的基因组DNA拷贝中检测一个拷贝的甲基化的基因组DNA。定量实时PCR(Q-PCR)允许用最少处理的样品在几小时内高度灵敏的定量感兴趣的基因的转录水平或DNA水平。感兴趣的基因的cDNA或基因组拷贝使用光学可检测的多核苷酸探针当PCR产物积累时通过检测PCR产物来定量。定量MSP(Q-MSP)允许通过实时PCR用甲基化特异性引物探针高度灵敏的检测基因启动子甲基化水平。

定量和多重MSP技术已被改进以在巢式或多重MSP测定中同时共扩增(co-amplify)数个基因来开发定量多重甲基化特异性PCR(QM-MSP)。QM-MSP方法基于实时PCR，其使用一个或更多个可区别的光学可检测探针以增加测定特异性和灵敏度使得可在100,000个未甲基化的基因拷贝中检测出一至十个拷贝的期望的甲基化基因。

来自本发明人的研究已表明一组(a panel of)甲基化标志物可在来自导管液(ductal fluid)的细胞中和在自发乳头溢液中检测100％的所有乳腺癌和95％的DCIS、和癌症。然而，来自血清/血浆的甲基化的DNA的可重复检测证明是更困难的。在过去15年中，许多研究已报道了在血清/血浆中使用单一或一组标志物检测乳腺癌。然而，还没有临床验证研究遵循这些初步结果，表明这一分析中还存在待解决的技术困难：1)首先，血清中脱落的甲基化的肿瘤DNA的量是由正常细胞脱落的总的未甲基化的DNA(匹配基因特异性DNA或参考DNA诸如肌动蛋白)的非常小的部分。体液中未甲基化的或参考DNA与稀有的靶甲基化的DNA的相对丰度之间存在不均衡性。由于甲基化信号被更为丰富的种类掩蔽，这导致缺少稳固性测定；2)正常未甲基化的DNA脱落的程度每日波动并伴随各种临床状态，诸如外科手术或感染；如果参考波动，则误差存在于感兴趣的靶基因的％甲基化的解释中；3)可用的最灵敏的测定利用巢式PCR(进行或不进行多重)以使用在感兴趣的区域外侧的外部引物预扩增靶DNA和参考DNA的扩增子，随后进行两轮定量PCR。但存在技术限制使得靶DNA和参考DNA区域需要理想地使用同一对外部引物以相同效率在预扩增PCR反应中被共扩增，以维持靶DNA与参考DNA的准确起始比。在巢式PCR中，由于非同一基因之间引物杂交的效率差异，肌动蛋白或其他基因不能准确用作感兴趣的基因的参考。因此，取决于DNA特异性引物与靶和参考DNA的杂交的效率的相对差异，靶与参考的比随每个循环的预扩增而改变；4)现有血清MSP测定通常需要10-20ng基因组DNA/测定以一次测试一个基因。由于癌症患者的血清中总DNA的水平是低的[中值65.4ng/ml；范围6.3–268.6ng/ml；Holdenrieder等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1137:162-170(2008)]，数个基因的测定需要大量血清，因为来自现有临床研究的档案血清仅以小体积可用，使重复研究成问题且难以临床验证。