[发明专利]制备重组人酪氨酸酶的方法有效
| 申请号： | 201380039269.4 | 申请日： | 2013-07-10 |
| 公开（公告）号： | CN104662149B | 公开（公告）日： | 2018-11-20 |
| 发明（设计）人： | G.钱德拉莫里;S.马哈帕特拉;S.蒂马斯亚;D.H.丹德卡;S.克里斯兰 | 申请（专利权）人： | 荷兰联合利华有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/00 | 分类号： | C12N9/00;A61K8/66;A61Q5/10;C12N9/02 |
| 代理公司： | 永新专利商标代理有限公司 72002 | 代理人： | 林晓红;柴丽敏 |
| 地址： | 荷兰*** | 国省代码： | 荷兰;NL |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 制备 重组 酪氨酸 方法 | ||
【权利要求书】：
1.制备重组人酪氨酸酶的方法，其包括步骤
(i)使用PCR以密码子优化的方式合成制备人酪氨酸酶基因；
(ii)克隆所述基因至杆状病毒表达载体中；
(iii)从获得自步骤(ii)的克隆制备杆粒；
(iv)用所述杆粒感染昆虫细胞以制备病毒滴度；和
(v)对期望的人酪氨酸酶的表达筛选优化MOI(感染复数)和时间点，
其中步骤(v)中使用包含铜盐的细胞培养基，且其中以每升所述细胞培养基0.1至25微摩尔范围内的浓度包含所述铜盐，
其中所述人酪氨酸酶基因是跨膜区缺失的或是全长的，
其中所述跨膜区缺失的人酪氨酸酶基因的序列示于SEQ ID NO:4；
其中所述全长的人酪氨酸酶基因的序列示于SEQ ID NO:5；
其中所述载体是pFastbacTM；且
其中所述昆虫细胞是Sf9或HighFiveTM细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述铜盐是氯化铜或硫酸铜。
3.权利要求1或2的方法，其中以每升所述细胞培养基5微摩尔的浓度包含所述铜盐。
4.权利要求1的方法，其中所述方法包括裂解所述昆虫细胞以制备所述人酪氨酸酶的步骤。
5.权利要求1的方法，其包括从昆虫细胞生长培养基上清液中收集所述人酪氨酸酶的步骤。
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