[发明专利]工程化用于免疫疗法的异体和免疫抑制耐受性T细胞的方法

权利要求书

1.一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括：

(a)通过灭活至少以下各项改变T细胞：

-表达免疫抑制剂的靶标的第一基因，和

-编码T细胞受体(TCR)的组件的第二基因，

(b)可选地在所述免疫抑制剂的存在下，扩增所述细胞。

2.根据权利要求1所述的制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供T细胞；

(b)在表达免疫抑制剂的靶标的所述T细胞中选择基因；

(c)向所述T细胞中引入能够通过DNA断裂分别选择性地灭活以下各项的稀切内切核酸酶：

-编码所述免疫抑制剂的靶标的所述基因，和

-编码所述T细胞受体(TCR)的一种组件的至少一种基因，

(d)可选地在所述免疫抑制剂的存在下，扩增所述细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫抑制剂的靶标是免疫抑制剂的受体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述转化的T细胞在患者的血液中扩增。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述转化的T细胞在体内扩增。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述转化的T细胞在所述免疫抑制剂的存在下扩增。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述基因表达其为CD52的免疫抑制剂的靶标，并且所述免疫抑制剂是靶向CD52抗原的抗体。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述基因表达糖皮质激素受体(GR)，并且所述免疫抑制剂具体地是皮质类固醇，如地塞米松。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，至少两种灭活的所述基因选自由CD52和TCRα、CD52和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ组成的组。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶在步骤c)中共转染。

11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶是由mRNA编码的。

12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶在步骤(c)中通过RNA电穿孔的方式引入至所述细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，在步骤(c)中包括使所述T细胞与编码稀切内切核酸酶的RNA接触并施加由以下各项组成的agile脉冲序列：

(a)一个电脉冲，具有2250至3000V/cm的电压范围、0.1ms的脉冲宽度以及步骤(a)和(b)的所述电脉冲之间0.2至10ms的脉冲间隔；

(b)一个电脉冲，具有2250至3000V的电压范围、100ms的脉冲宽度以及在步骤(b)的所述电脉冲和步骤(c)的第一电脉冲之间100ms的脉冲间隔；以及

(c)4个电脉冲，具有325V的电压、0.2ms的脉冲宽度以及在4个电脉冲的每一个之间2ms的脉冲间隔。

14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶是TALE-核酸酶。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:60的TCRα的基因靶标序列中的一种。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的TCRβ的基因靶标序列中的一种。

17.根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的GR的基因靶标序列中的一种。

18.根据权利要求14所述的方法，其中，这些TALE-核酸酶中的至少一种针对选自SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:61至SEQ ID NO:65的CD52的基因靶标序列中的一种。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，包括向所述T细胞中引入嵌合抗原受体(CAR)。