[发明专利]用于改善细胞鉴定的方法

说明书

发明领域

本申请涉及免疫组织化学以及基于计算机的图像分析领域。具体地，本申请提供一种从组织学组织样品中提取信息并且利用该信息进行基于计算机的图像分析的方法。更具体地，本申请提供一种显现微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法。本申请还提供一种用于实施所述方法的部件的试剂盒。

发明背景

组织性组织样品的分析通常用于诊断目的，例如，分析乳腺组织样品来诊断乳腺癌，或用于研究目的，例如，研究炎性病症(如哮喘、动脉粥样硬化或炎性肠病)中的炎性细胞类型。

免疫组织化学(IHC)，其中通过抗原特异性抗体检测标记分子(即，抗原，典型地为蛋白)，其常用于鉴定组织学切片中的细胞。对于一些细胞类型，可以通过检测单个细胞特异性抗原获得鉴定。然而，组织细胞的免疫组织化学鉴定领域的显著问题是许多细胞不能仅通过一种标记分子鉴定的事实。用于一种细胞类型的候选鉴定标记也可以存在于一些其他细胞类型上，并且妨碍了正确的鉴定。因此，找到鉴定并且排除混杂细胞类型的方法对于没有细胞特异性标记可用的细胞类型的可靠的鉴定是至关重要的。理想地，正确鉴定后，可能需要用显现活化标记的另外的IHC染色来研究所鉴定的细胞的激活状态或通过原位杂交技术来显现基因表达。

任何患病的组织都典型地与改变的细胞群体的组成相关。例如，在哮喘的发炎的呼吸道中，存在构成呼吸道的结构细胞(如上皮细胞、腺细胞、血管细胞、神经等)的改变的组成。另外，一些类型的免疫细胞(即，白细胞)浸润发炎的呼吸道。事实上，在多种疾病中，组织的病理学(即，破坏性)改变不是仅被一种细胞类型引起的，而是几种细胞类型之间的复杂的相互作用。因此，当研究患病组织样品时，通常需要同时显现几种细胞群体和组织结构，或显现细胞群体与非细胞结构，如侵入的病毒或细胞外基质成分。

关于组织中细胞内容物的信息可以通过当时染色连续切割的切片中的一种细胞类型而获得。尽管这种方法提供组织样品中的几种细胞类型的内容物的良好的估测，但是其没能提供关于所分析的细胞类型之间的空间关系(即，物理关系)的详细信息。由于细胞之间的大部分交叉感知需要紧密的物理接触，有时是直接的物理接触，所以这是主要的缺点。因此，可能需要显现同一张切片内的几种细胞群体。

利用目前可用的IHC技术，使用复合色素原或复合免疫荧光技术可以染色一张切片中的至多3种细胞类型。然而，在常规的实践中，由于缺少一级检测抗体的适当的组合，通常仅可以同时检测2种细胞类型。

为了增加可以在一张组织切片中显现的标记的数目，已经开发了新的方法学方法，如WO 2010/115089中公开的SIMPLE技术，和MELC技术(Schubert等，Nature Biotechnology(自然生物技术)v.24，pp.1270-1278)。尽管有效力，但是这些新型技术主要开发用来共定位研究，并目每种都包括组织破坏性步骤、涉及破坏检测基团的步骤或依赖于检测分子标记的一级抗体。后一种限制排除了通过使用二级抗体对染色灵敏性的常规放大，使得这些方法对于检测常规组织学切片中的多种常规的细胞标记过于不灵敏。此外，由于上文提及的技术主要开发用于共定位研究，它们与其他常规免疫组织化学流程相似没能解决非目标细胞类型上偶然也可能存在多种鉴定标记的问题。

正确检测没有针对其的单一特异性标记的细胞类型的一种方法是通过现有的IHC检测和检测色素原的包封来排除混杂细胞类型。在Andersson等，Thorax 2009；vol.64，pp.297-305中，在线补充数据公开了一种方法，其中通过两步法分离了黏膜肥大细胞(MC_T，对类胰蛋白酶是阳性的)和结缔组织肥大细胞(MC_TC，对糜蛋白酶和类胰蛋白酶是阳性的)，其中第一IHC步骤通过棕色色素原DAB检测糜蛋白酶，而第二步骤通过红色色素原新品红检测余下的糜蛋白酶-阴性MCt细胞。尽管可用于检测组织切片中的MCt和MCTc群体，主要的缺点是由于其不透明的染色和由检测色素原引起的空间位阻，色素原包封的细胞都不能被进一步研究。因此，需要一种改善的且灵活的允许显现样品中的多种细胞标记的显现方法。具体地，需要非组织破坏性显现方法，所述方法使得其能够在最初的显现之后的后续步骤中进一步检测特定样品的感兴趣的细胞类型的细胞标记。

发明概述