[发明专利]寡糖的大规模酶合成的方法

权利要求书

1.一种以酶性方式合成寡糖的方法，其特征在于，包含：

(i)在UDP-Gal再生酶组的存在下，将半乳糖制成UDP-Gal，其中该UDP-Gal再生酶组包含半乳糖激酶、UDP-糖焦磷酸化酶及丙酮酸激酶；及

(ii)在UDP-Gal及α-1,4-半乳糖转移酶存在下，将乳糖-OR^1A(Lac-OR^1A)转换为Globo三糖-OR^1A(Gb3-OR^1A)，其中R^1A为氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的环碳基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基或氧保护基团、生物素或神经酰胺。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该UDP-Gal再生酶组包含焦磷酸化酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(i)及(ii)发生于Gb3-合成反应混合物中，该Gb3-合成反应混合物包括半乳糖、PEP、ATP、UTP、Lac-OR^1A、α-1,4-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在任何酶反应发生前，Lac-OR^1A与半乳糖在Gb3-合成反应混合物中的摩尔比为1：1。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该α-1,4-半乳糖转移酶是来自脑膜炎双球菌的LgtC，该半乳糖激酶是来自大肠杆菌，该UDP-糖焦磷酸化酶是来自拟南芥，该丙酮酸激酶是来自大肠杆菌，或该焦磷酸化酶是来自大肠杆菌。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb3-OR^1A。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含：

(iii)在UDP-GalNAc及β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶存在下，将Gb3-OR^1A转换成Globo四糖-OR^1A(Gb4-OR^1A)。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包含：

(iv)在UDP-GalNAc再生酶组存在下，将GalNAc制成UDP-GalNAc，其中该UDP-GalNAc再生酶组包含N-乙酰己糖胺1-激酶、N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶及丙酮酸激酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的UDP-GalNAc再生酶组还包含焦磷酸化酶。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，(iii)及(iv)在Gb-4合成反应混合物中进行，该Gb-4合成反应混合物包含GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-OR^1A、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶及UDP-GalNAc再生酶组。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该Gb-4合成反应混合物是通过将Gb-3合成反应混合物至少与GalNAc、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶混合制得。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶是来自流感嗜血杆菌的LgtD，N-乙酰己糖胺1-激酶是来自龙根菌，N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶是来自大肠杆菌，该丙酮酸激酶是来自大肠杆菌，或该焦磷酸化酶是来自大肠杆菌。

13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb4-OR^1A。