[发明专利]使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层

说明书

技术领域

本发明涉及从多能干(PS)细胞例如人定形内胚层产生胰内胚层的方法。

发明背景

β细胞移植潜在地提供了I型糖尿病的最终治疗。然而，供体β细胞有限的可用性制约了该治疗作为临床治疗的用途。多能干细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，PS细胞为有希望的β细胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可再生地分化为胰细胞。

在脊椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。对于形成内胚层衍生组织，定形内胚层(DE)的诱导是第一步；从DE细胞产生胰内胚层(PE)为产生产胰岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞(EP)潜能的PE细胞特征在于两个重要转录因子PDX1和NKX6.1的共表达。

对于从PS细胞产生胰细胞已经建立了分步体外分化方案。这些方案一般模拟胰发育的主要事件，其包括几个阶段例如共表达SOX17和FOXA2的DE、原肠、后前肠、PE、EP和最后成熟β细胞的形成。迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A处理实现。产生胰β细胞的下一个主要步骤为产生共表达PDX1和NKX6.1的PE。已开发出几组可将PS细胞分化为DE和PE的体外方案，然而其仅能产生中等分数的NKX6.1/PDX1双阳性(db +ve)细胞，而且重要的是其中无一能够体外产生完全成熟的β细胞(Cai等(2010); D’Amour等(2006); Kunisada等(2012); Schulz等(2012); Zhang等(2009); Ameri等(2010))。

概述

本发明涉及产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将定形内胚层(DE)细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：

a. BMP抑制剂LDN-193189 (在表1中列出)

b. 激酶抑制剂(在表1和表2中列出)

c. 视黄酸受体激动剂(在表2中列出)，

以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。

本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：

a. BMP抑制剂LDN-193189 (在表1中列出)

b. 具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体(在表1和2中列出)

c. 视黄酸受体激动剂(在表2中列出)，

以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体(pancreatic or pancreatic cell precursors)。

本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：

a. BMP抑制剂LDN-193189

b. JNK抑制剂II

c. AM580，

以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。

本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。

本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，并随后暴露于下列分子之一，

a. Wnt抑制剂IWP2

b. Hedgehog抑制剂环巴胺(Cyclopamine, Cyc)

以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。

本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，并随后暴露于JNK抑制剂II、视黄酸或视黄酸衍生物、bFGF和下列分子之一的组合：

a. Wnt抑制剂IWP2

b. Hedgehog抑制剂环巴胺

以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。