[发明专利]含有间充质干细胞的条件培养基的角膜内皮细胞培养用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种移植用角膜内皮细胞的培养法，具体而言，涉及一种用于培养移植用角膜内皮细胞的添加了间充质干细胞的条件培养基。

背景技术

角膜是透明组织，其从外侧向内侧由角膜上皮、前弹力层、角膜基质层、后弹力层、角膜内皮5层细胞层构成，其没有血管但有神经分布。角膜透明度通过角膜基质层和角膜内皮来维持。

角膜内皮功能不全是失明的主要原因之一，即，用于维持角膜透明度的角膜内皮功能丧失，从而引起视野受损。角膜内皮功能不全是由角膜内皮变性、坏死或物理脱落等引起的疾病。作为由角膜内皮细胞功能不全引起的疾病，有大泡性角膜病变。大泡性角膜病变是重度的角膜内皮功能不全，即，作为角膜内皮细胞功能之一的调节角膜内水分量的泵功能受损，其结果无法排出角膜内的水分，角膜浑浊呈浮肿状。另外，由于浮肿，角膜上皮有时会剥落。

正常角膜上的角膜内皮细胞的密度为约2500-3000个/mm²，但角膜内皮功能不全时，其角膜内皮细胞的密度减小。若细胞密度变为约500个/mm²以下，则角膜内皮细胞的泵功能及屏障功能下降，导致产生浮肿。

角膜内皮细胞一旦受到一次损害就不具有再生的能力。因此，作为这种角膜内皮功能不全的治疗，通过全层角膜移植，即移植具有上皮、基质及内皮的完整3层结构的健康角膜，来实现恢复角膜内皮功能，并恢复角膜的透明度。但是，由于全层角膜移植存在因角膜全层切开而引起的眼球的脆弱性等问题，因此近年来，正在普及仅移植角膜内皮的DSAEK(Descemet’s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty)、同时移植后弹力层和角膜内皮的DMEK(Descemet’s Membrane Endothelial Keratoplasty)(非专利文献1)。对于需要这种角膜移植的由角膜内皮功能不全引起的疾病，除了大泡性角膜病变，还可以列举角膜浮肿、角膜白斑、圆锥角膜等。但是，在日本，等待角膜移植的患者约5500人，与此相对，一年在日本国内进行角膜移植件数为2700件左右。即现状为，由于捐赠者不足而不能对患者采取充分的措施。

作为解决这种捐赠者不足的方法之一，研究了培养角膜内皮细胞，并将其移植给角膜内皮功能不全患者，从而恢复角膜内皮功能的方法。例如，报告了在羊膜上培养角膜内皮细胞而制造移植用角膜内皮样片的方法(专利文献1及2)。在这些报告中，作为角膜内皮细胞培养用培养基，使用添加了10％FCS、2ng/mL b-FGF及抗生素的DMEM培养基(专利文献1)，或者使用含有10％FCS的DMEM培养基(专利文献2)。另外，还报告了在纤连蛋白包覆的胶原蛋白片上培养角膜内皮细胞而制造移植用角膜内皮样片的方法(专利文献3)、在纤维素基材上培养角膜内皮细胞而制造移植用角膜内皮样片的方法(专利文献4)。在这些报告中，作为角膜内皮细胞培养用培养基，使用添加了15％FCS、2ng/mL b-FGF及抗生素的低葡萄糖浓度DMEM培养基。另外，公开了可以在培养基中添加透明质酸及EGF等生长因子。此外，还报告了各种作为角膜内皮细胞培养用培养基的培养基(非专利文献2)。

角膜内皮细胞的培养中存在这样的问题：角膜内皮细胞在培养中发生形态变化，变为成纤维细胞样细胞(专利文献4及非专利文献3)。

因此，报告了如下方法：即，通过在存在Rho激酶抑制剂的状态下培养角膜内皮细胞，从而防止角膜内皮细胞的形态变化并且促进角膜内皮细胞的附着，进而制造具有高细胞密度的移植用角膜内皮细胞层的方法(专利文献5)。在这里，作为角膜内皮细胞培养用培养基，使用添加了15％FCS、2ng/mL b-FGF及抗生素的低葡萄糖浓度DMEM培养基，作为基础培养基(非专利文献4)。此外，已知当人ES细胞在培养中发生细胞死亡时，Rho激酶活化，并且已知，抑制Rho激酶的ROCK抑制剂((+)-反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰)环己烷、1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪等)抑制这种细胞死亡(非专利文献5)。

此外，作为培养角膜内皮细胞的方法，已知有如下角膜内皮细胞的培养法：使用添加了20ng/mL NGF、5ng/mL EGF、20μg/mL抗坏血酸、200μg/mL CaCl₂、100μg/mL下垂体提取物、及0.08％(w/v)硫酸软骨素及抗生素的Opti-MEM-1(Gibco公司制)的培养法(非专利文献6)。但是，使用了培养角膜内皮细胞所得到的细胞的、用于改善角膜内皮功能不全患者的角膜内皮功能的移植治疗，还没有达到实用化。