[发明专利]siRNA及其在用于治疗和/或预防眼部病症的方法和组合物中的应用

说明书

发明领域

本发明涉及提供siRNA产物及其在利用RAN干扰用于治疗和/或预防与瞬时感受器电位香草素(transient receptor potential vanilloid，TRPV1)的高水平表达和/或活性相关的眼部病症的方法和组合物中的应用。其中，与眼睛疼痛相关的眼部病症，如屈光手术后的角膜不适和改变的敏感性、使用隐形眼镜、干眼综合征和舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)，将得到减轻。

发明背景

RNA干扰(RNAi)是大部分真核细胞的天然存在的调节机制，其使用小的双链RNA(dsRNA)分子来指导同源依赖性基因沉默。Fire和Mello在虫子秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现RNA干扰{Fire，1998}于2006年被授予诺贝尔奖。在其第一次记载后不久，RNAi也被表明在哺乳动物细胞中发生，不是通过长的dsRNAs而是提供过21个核苷酸长的双链小干扰RNAs(siRNAs)发生{Elbashir，2001}。

认为RNA干扰过程是用于防止外源基因表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由多个门和群所共有，其中其称为转录后基因沉默。

由于RNAi机制的发现，研究已经激增，以发现可以选择性改变基因表达的新化合物作为治疗人类疾病的新方法，其通过针对使用包括小分子或蛋白的传统药物方法而是“不能用药的”靶标而进行治疗。

按照目前的常识，当长的双链RNAs被称为切酶(Dicer)的RNA酶III样蛋白加工时，起始RNAi机制。蛋白切酶典型地包含N端RNA解旋酶结构域、结合RNA的所谓的Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)结构域、两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域(dsRBD){Collins，2005}，并且其活性引起将长的双链RNAs加工成具有2个碱基的3’突出端和5’磷酸和3’羟基的21-24个核苷酸的双链siRNAs。然后，得到的siRNA双链体结合在称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的效应子复合物中，其中，当通过RNA解旋酶活性腺苷-三磷酸(ATP)-依赖性解旋双链siRNA分子{Nykanen，2001}时，该siRNA的反义或引导链引导RISC是被并且分裂目标mRNA序列{Elbashir，2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活性由核酸内切酶Argonaute 2(AGO2)调节{Liu，2004；Song，2004}。AGO2属于高度保守的Argonaute蛋白家族。Argonaute蛋白是含有两个共有结构域，即PIWI和PAZ结构域的～100KDa的高碱性蛋白{Cerutti，2000}。PIWI结构域对于与切酶相互作用是极其重要的，并且含有负责mRNAs分解的核酸酶活性{Song，2004}。AGO2利用siRNA双链体的一条链作为向导以发现含有互补序列的信使RNAs，并且分解相对于引导链5′末端的碱基10与11之间的磷酸二酯骨架{Elbashir，2001}。RISC活化过程中的重要步骤是通过AGO2分解有义链或过客链，从复合物中去除该链{Rand，2005}。分析siRNA引导链与PIWI结构域之间的相互作用的结晶学研究揭示仅核苷酸2-8组成引导RISC识别靶标mRNA的“种子序列”，并且在该序列中单个核苷酸的错配可能彻底影响该分子的沉默能力{Ma，2005；Doench2004；Lewis，2003}。一旦mRNA已被分解，并且由于在片段中存在未保护的RNA末端，则所述mRNA被细胞内的核酸酶进一步分解和降解，并且将不再翻译成蛋白{Orban，2005}，而RISC将重新循环至后续的轮数中{Hutvagner，2002}。这组成导致特定的mRNA分子和相应的蛋白的选择性减少的催化过程。可以以通过直接向细胞或组织中递送siRNA效应子而调节任意选择的基因的目的来研究这种天然的基因沉默机制，其中其将激活RISC并且产生所靶向的mRNA的有效的且特异性的沉默。