[发明专利]用于确定受试者对以自由基引起的DNA损伤为特征的疾病状态的倾向的方法和分析产品

说明书

本发明涉及确定自由基引起的DNA损伤的方法。更具体地涉及确定受试者对以自由基引起的DNA损伤为特征的癌症或其他疾病状态诸如COPD或哮喘的倾向的方法。

本发明还涉及确定受试者与某些癌症有关的当前状态。

本发明还涉及确定受试者对电磁(EM)辐射引起的细胞损伤的敏感性的方法。具体地，本发明涉及确定受试者对紫外辐射(UV)引起的细胞损伤的敏感性的方法。

本发明还涉及用于实施本发明的方法的分析产品或相关试剂盒。

对细胞的氧化DNA损伤是细胞代谢的不可避免的结果；但是，与外源性起因诸如致癌化合物、氧化还原循环药物、电离和UV辐射互作也促进氧化损伤。

UV可被用作物理通用诱变因素以体外引起DNA损伤。与化学基因毒素相比，利用UVA光的优势是暴露时间的精确设定。化学基因毒素要求通过离心和洗涤步骤来移除。

UVA是太阳光的部分，太阳光在海平面的电磁波谱(290-5000nm)不仅包括可见的(56％)和红外区的(39％)部分，还包括紫外(UV)光(5％)。大部分的UVA(320-400nm)以及由于大气吸收而至更小程度的UVB(290-320nm)到达地球表面，而杀菌的UVC部分被完全地过滤掉。UVA/UVB光曾普遍地被描述为环境的人类致癌物质，也是红斑(太阳晒伤)、晒黑、光老化和免疫抑制的原因。但是，人工UV来源，主要地发射UVA，也在晒黑工作室(tanning studios)以及用于银屑病的治疗中被发现。在组织中UVA的吸收导致活性氧和氮物质以及不稳定铁的生成，其可转而伤害其他生物分子诸如DNA。UV暴露后最常见的DNA损伤类型是主要由临界量的UVB促进的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)，而UVA引起的氧化DNA损伤像8-oxo10鸟嘌呤取决于存在于细胞中的非DNA发色团。

UV吸收生成通过一系列的光产物的生成来引起DNA损伤的氧衍生自由基。这个过程可改变正常DNA的碱基配对能力，导致突变。正是这些突变可引起癌症，因为它们破坏肿瘤抑制基因诸如P53、和INK4A。自由基在很多类型的癌症中发挥作用。有证据表明，ATM(毛细血管扩张性共济失调突变)和ATR(Rad3相关的)基因的自由基相关突变在淋巴瘤的生成中发挥作用。

在过去的大约二十年，彗星实验(Comet assay)、或单细胞凝胶电泳实验已变成通过评价在细胞中的DNA链断裂来评估DNA损伤的标准方法之一。将包埋在显微镜载玻片上的琼脂糖中的细胞用去污剂和高盐浓度裂解以形成包含连接至核基质的DNA的超螺旋环的类核。

在高pH下的电泳引起通过荧光显微术观察到的像彗星的结构，其中彗星的尾巴相对于头部的强度反映DNA链断裂的数目以及碱不稳定位点。含有断裂的环失去其超螺旋并自由地向正极移动。因此彗星实验提供了确定基因组损伤的手段。

可通过利用成像软件手工打分来进行荧光的计算以确定DNA损伤的程度。

最近已发现癌症自身并且最可能地其癌前状态可导致对整个生物体的应激。然后这个事实可导致在对细胞中与癌症无关的外源性基因毒性损害的敏感性上的不同。归因于环境应激物或生活方式因素的损害可随后地在敏感细胞中引起更高的损伤。

以前，发明人曾使用传统的彗星试验及其新的变化形式(例如参见WO2008/050134)作为针对皮肤的模型以确定测试物质诸如防晒霜(sun screen)保护细胞免受UV损伤的能力。但是，这种方法要求显著的预处理步骤如需要样品为淋巴细胞的形式。而且，淋巴细胞样品层用一种(针对传统的彗星实验)或更多种(针对新颖的3D实验)另外的屏障层覆盖以提供将样品包在内部的三明治效应。这导致相当地费力的过程。

提供确定细胞对电磁辐射的敏感度的改良的方法是期望的。确定受试者是否对以DNA损伤为特征的癌症或其它疾病具有倾向是期望的。

根据本发明的一方面，本发明提供了筛查受试者对以DNA损伤为特征的疾病的倾向的方法，包括以下步骤：

从受试者获取全血；

将所述全血的多个样品封固在基底上；

将样品暴露至电磁辐射的不同水平或强度；

检测在每个样品中的遗传损伤水平；以及

将损伤水平与预先确定的值或值的模式比较。

优选地筛查方法包括最后步骤：

从所述比较确定相关诊断结果。

本发明显示了比现有技术的方法在多个组之间更明确的分离。其还允许结果的更好的再现性。

优选地将每个样品暴露至不同水平的电磁辐射的步骤通过改变辐射源和样品之间的距离以产生针对每个样品的正确强度来进行。