[发明专利]用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于将样品中的生物靶标与其标记快速分离的方法和组合物。

发明背景

生命科学和医学领域中的许多不同应用需要对生物靶标(诸如分子、DNA、蛋白质或细胞)进行特异性标记。标记提供使用标记的新的功能或物理特性(荧光、磁性、密度、酶活性、放射性等)对来自复杂生物样品内的靶标进行检测或操纵的灵敏方法。例如，荧光标记能够使生物靶标(在某些情况下以分子灵敏的程度)可视化。荧光技术正在革新从研究工作台到临床的许多生物学领域。同样地，磁性标记能够实现使用磁共振成像(MRI)或医学颗粒成像(MPI)技术(均为当前重要的临床诊断手段)对生物靶标进行成像。磁性标记的另一个重要应用是用于使用磁场从复杂样品中分离和纯化生物靶标(主要是DNA、蛋白质或细胞)。

磁性标记和分离已被广泛应用，并革新了细胞分离领域。细胞分离涉及在细胞物理或功能特性基础上从复杂生物样品(血液、组织、骨等)中分离特定细胞类型。荧光激活细胞分选(FACS)是一种在用荧光抗体标记后细胞受体表达的基础上分离所述细胞的流式细胞术形式。然而，FACS的缺点是分离费时且产量低。对于磁性分离，通常利用蛋白质或抗体的亲和结合特性(通常称为免疫标记的方法)使磁性微粒或纳米颗粒靶向细胞受体。缀合到抗体或蛋白质的磁性微粒或纳米颗粒用于选择性地靶向复杂的生物样品内的细胞。阳性选择是所需细胞类型被颗粒直接标记并通过磁性洗涤分离的常用方法。相反，对于阴性选择(或贫化/富集)，不需要的细胞类型被颗粒标记并通过施加磁场而去除，以未标记的形式分离所需细胞。阳性选择的优点是分离的细胞通常比阴性选择的纯度更高，但缺点是它们具有结合到其表面上的颗粒。阴性选择使得所需细胞保持未被标记，但缺点是纯度通常比阳性选择更低，并且需要混合多个抗体以标记不想要的细胞。阳性和阴性免疫磁性细胞分离策略是目前众多商用产品支持的完善技术。这些产品通常采用缀合到一级或二次抗体、缀合到链霉亲和素以与生物素化的抗体一起使用或缀合到葡聚糖以与四聚体抗体复合物(TAC)一起使用的磁性颗粒。

细胞分离领域目前要求更快还更复杂的策略以从相同样品中分离多种细胞类型、以分离不容易由其受体表达定义的细胞亚群，并且要求改进的策略用于分离非常罕见的细胞类型，在所有这些的同时保持细胞天然或接近天然状态。对于免疫磁性技术，分离多种细胞类型或不由单一受体表达定义的细胞类型的方法是采用阳性或阴性选择和正交标记技术的组合。大多数连续分离应用，特别是涉及多个阳性选择或阳性选择随后阴性选择的那些应用，要求在第一轮分离后从细胞表面有效去除磁性标记，而不损害细胞的活力或回收率(产率)。即使对于简单的阳性选择，非常需要以去除颗粒的方式来减轻颗粒对细胞的功能或活力的干扰。已知的是微粒或纳米颗粒可以通过不同的方法内化到细胞中，这取决于颗粒表面的物理和化学特性以及具体的细胞类型(Verma and Stellacci 2010)。除了细胞功能，细胞表面上的颗粒可干扰许多下游测定。例如，在流式细胞术分析过程中，当颗粒存在时细胞的粒度测量(侧向散射)向较大的值偏移，这使识别特定细胞群变得复杂。在细胞表面上具有颗粒的另一缺点是，氧化铁可以淬灭荧光信号，从而降低了在分离的细胞上进行免疫荧光测定的灵敏度。从临床前和临床观点来看，如果要将分离的细胞用于包括细胞治疗应用的人类研究中，那么重要的是细胞呈其天然或接近天然形式、不含杂质和颗粒、具有高功能性和活性。

温和地从细胞表面去除颗粒仍然是一个挑战，因为免疫细胞分离领域的技术人员知道，高亲和力抗体/抗原或蛋白质相互作用(K_D～1-100nM)需要将颗粒和细胞连接一起。此类高亲和力相互作用能够在若干轮磁性洗涤下以高纯度和产率分离细胞，但通常仅在对细胞有破坏性的溶液条件下逆转。在过去的20年中，已经提出许多不同方法以从细胞中去除颗粒，但许多方法损伤细胞、降低活力、改变功能特性或者它们过于复杂和费时。

这些策略中的一些包括将细胞在培养基中过夜温育、改变pH、温度、盐、加入还原剂来裂解抗体，或使用机械剪切力来破坏来自细胞表面的颗粒。

美国专利号5,081,030描述了使用消化酶如木瓜蛋白酶从细胞去除颗粒的方法。同样，欧洲专利号EP0819250B1描述了使用糖苷酶来释放颗粒的方法。一旦抗体缀合的颗粒已经靶向细胞并且细胞被磁性纯化，则将酶加至细胞悬液中以消化参与颗粒细胞连接的蛋白质、抗体或多糖。此方法的缺点是，酶的成本高昂，它们在储存过程中容易分解，所述方法是费时的，而且某些酶通过消化细胞表面蛋白而改变细胞功能。