[发明专利]弓形体属的减毒株用于预防或治疗隐孢子虫病的用途

说明书

本发明涉及寄生虫减毒株用于预防或治疗与顶复门动物相关的病理学状况的用途。

顶复门动物是大多数地细胞内的专性寄生虫，其具有可以涉及数个宿主的生活史。这些寄生虫的门细分为几个科。

鼠弓形体(Toxoplasma gondii(T.gondii))属于肉孢子虫科(Sarcocystidae)。该原生动物以随着宿主和感染阶段而变化的三种感染形式存在：

●速殖子：在中间宿主(即所有恒温动物)和终宿主(即猫科动物，特别是猫)的细胞中无性繁殖的增殖和感染形式，

●慢殖子：包含在包囊中的该寄生虫的具有缓慢分裂和低代谢水平的形式，

●子孢子：包含在卵囊中的形式，其产生自该寄生虫在终宿主(即猫和其他猫科动物)的肠中的有性繁殖。

猫(该寄生虫的终宿主)通过摄入包含包囊(或速殖子，如果动物处于弓形体病的急性期)的被寄生的猎物或通过摄入卵囊而受到感染。在经由配子囊于猫科动物的肠中进行有性繁殖后，卵囊被散布到环境中。这些卵囊在外部环境中形成孢子，并且其致病性持续至少一年。在卵囊摄入后，所释放出的子孢子感染终宿主或中间宿主的肠细胞并转变为在生物体中散布的速殖子。在免疫系统的压力下，速殖子被包于包囊内，具有对于中枢神经系统、视网膜或肌肉的优先向性。摄入含包囊的组织是污染终宿主和中间宿主的第二个原因。在摄入包囊后，慢殖子被释放并感染肠上皮细胞，并且转变为在宿主中散布的速殖子。

鼠弓形体株系按照其体内毒力程度来进行分类：I型株系(即株系RH)是高毒力的，而II型(即株系ME49、76K或Pru)和III型(即株系CEP或M7741)株系是毒力较小的并且通常建立慢性感染。此外，鉴定出了许多不能归于这三种主要类型的非典型株系，尤其是在非洲和南美洲(Howe DK等人,1995,J.Infect.Dis.,171,1561-1566；Rajendran C等人,2011,Infect.Genet.Evol.,12,359-368；Mercier A等人,2010,PLoS Negl.Trop.Dis.,4,e876)。

最近，通过使编码蛋白TgMIC1和TgMIC3的两个基因无效而制作出了鼠弓形体(对弓形体病负有责任的寄生虫)的减毒活株系(EP 1 703 914 B1和US 7,964,185 B2/Cérède等人,2005,J.Exp.Med.,201:453-63)。称为Toxo mic1-3 KO的该株系产生针对鼠弓形体的强烈且特异的免疫应答，并且使得能够在小鼠中(等人,2005,J.Infect.Dis.,194:1176-1183)和还有在母羊中(Mevelec等人,2010,Vet.Res.,41:49)预防以后感染的效应。还已经证明，体内毒力仅非常少地受到TgMIC1或TgMIC3的孤立失活的影响；相反地，通过这两种蛋白质的同时失活强烈地降低了体内毒力，这表明了这两种蛋白质的协同作用(Cérède等人,2005J.Exp.Med.,201:453-63)。

犬新孢子虫(Neospora caninum)是对新孢子虫病负有责任的细胞内寄生虫。它也属于肉孢子虫科。犬新孢子虫的生活史非常近似于鼠弓形体的生活史，具有两个不同的阶段：在终宿主(即犬科动物，特别是狗)中的有性阶段，其导致包含子孢子的卵囊的产生，所述卵囊被排到粪便中；和在中间宿主(即绵羊、山羊、牛、马科动物等)中的无性阶段，其导致速殖子的产生和随后包含慢殖子的包囊的产生。

更近来，获得了犬新孢子虫的减毒活株系，株系Neo ncmic1-3KO，其已通过同源重组而对于基因ncmic1和ncmic3而言被无效。在该株系中，用允许对于乙胺嘧啶的抗性的盒DHFR替代基因ncmic3，和用赋予寄生虫以对于氯霉素的抗性并使寄生虫发荧光的盒CAT-GFP替代基因ncmic1。该寄生虫不再表达蛋白NcMIC1和NcMIC3。已显示，该突变株具有感染和免疫原特性，从而赋予哺乳动物以针对新孢子虫病的有害效应的疫苗保护。

鼠弓形体和犬新孢子虫共同具有以多个步骤侵入宿主细胞的特殊过程，从而导致形成寄生泡，在所述寄生泡中寄生虫进行繁殖和发育。

隐孢子虫科(Cryptosporidiidae)是另一个属于顶复门的科，并且对隐孢子虫病负有责任，所述隐孢子虫病是极其常见的疾病，其通过存在于它们食物中的寄生虫的摄入而影响尤其是人和许多动物物种，包括农用动物(绵羊、山羊、牛等)。在这之后，寄生虫在肠中进行繁殖，首先按照无性方式，然后其次按照有性方式。被污染的个体排出并再次散布寄生虫，其因此污染了它们的环境(即牧场、水等)。