[发明专利]用于基因打靶和性状堆叠的工程化转基因整合平台(ETIP)

权利要求书

1.一种用于生成转基因植物细胞的方法，该方法包括：

提供植物细胞，其具有包含可靶定核酸分子的基因组DNA，该可靶定核酸分子包含：

至少一个位点特异性核酸酶识别位点；

第一标志物基因的第一片段；和

第二标志物基因的第二片段；

用供体核酸分子和位点特异性核酸酶核酸分子转化植物细胞；

切割至少一个位点特异性核酸酶识别位点；

将供体核酸分子整合入可靶定核酸分子，其中可靶定核酸分子内的整合包含至少一种功能性标志物基因；并

生成转基因植物细胞，该转基因植物细胞包含可靶定核酸分子和整合的、包含至少一种功能性标志物基因的供体核酸分子。

2.权利要求1的方法，其中供体核酸分子包含第一和第二同源臂核酸序列。

3.权利要求2的方法，其中同源臂核酸序列为内含子。

4.权利要求2的方法，其中第一和第二同源臂核酸序列共享少于50％序列同一性。

5.权利要求2的方法，其中第一和第二同源臂核酸序列长50bp至3kbp。

6.权利要求1的方法，其中供体核酸分子经非同源性依赖性方法整合入可靶定核酸分子。

7.权利要求1的方法，其中供体核酸分子经同源性依赖性方法整合入可靶定核酸分子。

8.权利要求1的方法，其中供体核酸分子的两端均整合入具有核苷酸序列重排的可靶定核酸分子，其中该核苷酸序列重排包含插入、删除、倒置和重复。

9.权利要求1的方法，其中供体核酸分子的两端均整合入没有核苷酸序列重排的可靶定核酸分子，其中该核苷酸序列重排包含插入、删除、倒置和重复。

10.权利要求1的方法，其中供体核酸分子的第一端整合入没有核苷酸序列重排的可靶定核酸分子，且供体核酸分子的第二端整合入具有核苷酸序列重排的可靶定核酸分子，其中该核苷酸序列重排包含插入、删除、倒置和重复。

11.权利要求1的方法，其中将转基因植物细胞生成转基因植物组织或再生成完整转基因植物。

12.权利要求1的方法，其中将可靶定核酸插入基因组基因座。

13.权利要求12的方法，其中可靶定核酸分子在基因组基因座内的插入对植物细胞的农艺或质量特性没有不利影响。

14.权利要求12的方法，其中基因组基因座选自下组：FAD2基因组基因座，FAD3基因组基因座，和IPK1基因组基因座。

15.权利要求14的方法，其中FAD2基因组基因座选自下组：FAD2A，FAD2A’，FAD2C，和FAD2C’。

16.权利要求14的方法，其中FAD3基因组基因座选自下组：FAD3A，FAD3A’，FAD3A”，FAD3C，FAD3C’，和FAD3C”。

17.权利要求1的方法，其中供体核酸分子包含至少一种基因表达盒。

18.权利要求1的方法，其中基因表达盒包含转基因。

19.权利要求18的方法，其中转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因，除草剂耐性转基因，氮利用效率转基因，水利用效率转基因，营养质量转基因，DNA结合转基因，和可选择标志物转基因。

20.权利要求1的方法，其中用位点特异性核酸酶切割至少一个位点特异性核酸酶识别位点。

21.权利要求20的方法，其中位点特异性核酸酶为包含DNA结合域和切割域或切割半域的融合蛋白。

22.权利要求21的方法，其中DNA结合域选自下组：大范围核酸酶DNA结合域，RNA指导的CRISPR-Cas9DNA结合域，亮氨酸拉链DNA结合域，转录激活物样(TAL)DNA结合域，重组酶，锌指蛋白DNA结合域，和它们的嵌合组合。

23.权利要求21的方法，其中融合蛋白为锌指核酸酶。