[发明专利]藻蓝蛋白的提取和稳定化方法以及其应用

说明书

本发明的目标在于藻蓝蛋白的提取和稳定化方法，以及其尤其在诊断中和在医学、食品或美容学领域中或者作为食品补充剂的应用。

藻蓝蛋白是一种水溶性蛋白质，其是蓝细菌例如螺旋藻(钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)或极大螺旋藻(Spirulina maxima))或AFA(水华束丝藻(Aphanizomenon Flos-Aquae))的主要色素之一。在静止时，藻蓝蛋白具有蓝颜色并且它被赋予了红色荧光。它在620nm处具有最大吸收并且在635nm处具有发射辐射。该性质使得其成为一种为在生物医学诊断中的优异的标记物的天然荧光产物。

在生理学方面，藻蓝蛋白也是一种重要的抗氧化剂，尤其是用于保护血浆蛋白免于氧化修饰。藻蓝蛋白的化学结构具有与胆红素(其是血红蛋白的降解产物)非常接近的结构相似性和相当近似的特性。

藻蓝蛋白是一种具有很大好处的分子，尤其是由于其对于人和动物健康有益的特性。藻蓝蛋白尤其因其抗氧化特性和还因其促进干细胞产生的能力而被消费。

然而，它是一种昂贵且难以提取的分子。此外，它是一种在细菌污染的情况下在提取后非常快地降解的分子，这抬高了成本，因为以液体形式，在水中，该分子应当在无菌条件下进行提取并且包装成单剂量。

已经提出了各种不同的提取方法，其中包括切向流过滤、加速溶剂提取、细胞裂解和两相水提取。

专利FR 2 789 399描述了在0.2微米下的切向流过滤方法，其使得能够在水性介质中以冷的状态且无菌地提取藻蓝蛋白。然而，该方法需要重大投资，因为切向流过滤设备是非常昂贵的，并且它意味着单剂量包装，例如玻璃安瓿瓶，因为在打开后该介质就不再是无菌的并且藻蓝蛋白在这些条件下不能保存在水中。

在用甘油代替水作为溶剂的情况下，该方法非常难以施行，因为甘油具有对于允许在良好的条件下施行切向流过滤来说过大的粘度。

持续少于三十分钟的加速溶剂提取方法的特征为维持溶剂处于其沸点之下的高的温度和压力。在该方法中，测试了各种不同的溶剂：己烷、石油醚、乙醇和水，在60、115和170℃的温度下以及3、9和15分钟的各种不同提取时间。所有这些溶剂都存在问题：己烷和石油醚是有毒的。乙醇允许最有效的提取，但存在许多问题；毒性、在某些宗教中的禁律和比用己烷或石油醚(其具有非常低的提取产率，对于己烷仅为4.30％，和对于石油醚仅为3.60％)大得多的抗氧化活性的丧失。至于水，存在保存的问题，因为在细菌污染的情况下，藻蓝蛋白在几天内就降解了。

最经常使用的细胞裂解技术涉及下述的冷冻-解冻阶段的交替：

·要么，超声处理，其使细胞膜破裂并因此有助于接近存在于细胞质和胞内细胞器中的分子；

·要么，在冷冻-解冻步骤期间添加pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液，然后通过搅拌器，随后为用盐酸进行提取的步骤。

然后，通过离心步骤来进行各种不同组分的分开和浓缩，所述离心步骤使得能够收集其中存在有藻蓝蛋白的上清液。

该技术具有缺点，这是由于以水性形式的藻蓝蛋白在细菌污染的情况下迅速降解并因此应当以无菌形式或以冷的(冷冻)状态进行保存，这引起重大的额外费用。

两相水提取牵涉分子在两个或更多个不混溶的水相之间的分开。向给定量的新鲜的藻蓝蛋白提取物添加聚乙二醇(PEG)和磷酸钾。在混合和倾析后，该系统分开成两个相。然后，通过离子交换色谱法和UV光谱学来分析这些相以评估藻蓝蛋白和总蛋白质的纯度和量。使用PEG和磷酸钾的混合物来实现藻蓝蛋白与其他蛋白质之间的分配系数。然后，使该系统经历两相水提取。为了增加纯度，进行离子交换色谱法。尽管该提取方法使得能够获得良好的藻蓝蛋白浓度，但是它具有需要许多且复杂的步骤和需要使用尖端且昂贵的设备这样的缺点。

因此，对于易于实施且经济上令人满意的用于获得藻蓝蛋白的方法存在需要。

一个额外的要求涉及所获得的藻蓝蛋白溶液的稳定性。这是因为，已知在水性介质中，通过热或紫外线来进行的灭菌降解藻蓝蛋白分子并且在包装打开后丧失全部效力，这意味着单剂量包装。化学防腐剂具有毒性，这使得它们对于食品用途来说是不相容的。只有用精油来进行的试验给出了可接受的结果。罗文莎(樟树(Cinnamomum Camphora))的精油延迟了细菌成长，同时保持与食品用途相容，但是该处理仅适合于藻蓝蛋白的短期储存，因为细菌成长被减慢但未被消灭。同样也不可能使介质强烈地酸化以阻止细菌的成长，因为藻蓝蛋白对于pH非常敏感并且任何重大变化都引起分子发生沉淀。藻蓝蛋白在pH 5以下和pH 7.5以上变得不稳定并且发生沉淀。