[发明专利]用于具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的生产方法

权利要求书

1.一种生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，所述方法包括：

(a)培养产生肺炎球菌血清型的细菌细胞，同时将发酵液的pH保持在7.0至9.4的范围；

(b)在所述发酵液的吸光度保持恒定时至所述吸光度开始下降时之间的时刻终止步骤(a)的所述培养；

(c)在不添加pH调节剂的情况下对步骤(b)的所述发酵液进行另外的培养，直到所述发酵液的pH达到5.5或更低的pH；

(d)将裂解剂加入至获得自步骤(c)的所述发酵液以裂解细胞，沉淀蛋白，并去除沉淀的蛋白和细胞碎片以获得澄清的细胞裂解液；以及

(e)从获得自步骤(d)的裂解液中分离和纯化所述荚膜多糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肺炎球菌血清型是1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)的所述培养是在50至150转/分的搅拌下在34℃至38℃进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，通过从所述发酵液的吸光度保持恒定的时刻起1至3小时内终止步骤(a)的所述培养来进行步骤(b)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)的所述另外的培养是在50至150转/分的搅拌下在34℃至38℃进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中使用的所述裂解剂是脱氧胆酸钠。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将所述裂解剂加入至获得自步骤(c)的所述发酵液进行步骤(d)以裂解细胞，然后在不搅拌的情况下将所得的细胞裂解液在10℃至20℃孵育3至24小时以沉淀蛋白，并且通过离心去除沉淀的蛋白和细胞碎片。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)的所述分离和纯化包括：

(i)使用深层过滤器过滤获得自步骤(d)的所述裂解液；

(ii)浓缩获得自步骤(i)的滤液，然后超滤和离心；

(iii)使获得自步骤(ii)的上清液与阳离子表面活性剂反应，并且随后离心所得的溶液以获得含有荚膜多糖的粒料或上清液；

(iv)使获得自步骤(iii)的所述荚膜多糖与碘化钠反应，然后离心，从而获得上清液；

(v)将活性炭加入至获得自步骤(iv)的溶液，然后过滤；以及

(vi)浓缩获得自步骤(v)的滤液，然后超滤和离心，从而获得荚膜多糖。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，使用100kDa的膜进行步骤(ii)的所述浓缩。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，使用30kDa的膜进行步骤(vi)的所述浓缩。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(iii)中使用的所述阳离子表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述十六烷基三甲基溴化铵以0.5％至3.0％的浓度使用。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(v)中使用的所述活性炭以1％至5％w/v的浓度使用。