[发明专利]FAD2性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白

说明书

公开了在FAD2基因座中进行基因破坏、基因编辑或基因堆叠的方法和组合物，其是通过以定点的方式剪切大豆细胞FAD2基因中的一个位置，从而在FAD2基因中产生断裂(break)，然后任选地该断裂中整合入感兴趣的核酸分子。

相关申请交叉引用

本申请要求获得于2012年9月7日提交的美国临时专利申请No.61/697,886的优先权，本文通过提述并入其全部内容。

公开领域

本公开一般地涉及用于植物重组技术(例如，用于产生转基因植物)的组合物和方法。更具体地，本公开涉及植物细胞和植物，它们的基因组中包含可用于位点特异性地引入任何感兴趣核酸的基因座。

背景

许多植物被外源核酸(例如转基因)遗传转化以引入期望的性状，例如提高农业价值。可以通过遗传转化提高农业价值的实例包括：提高营养品质，提高产量，害虫或疾病抗性，干旱和胁迫耐受性，提高园艺品质(例如，改善色素沉着和/或生长)，除草剂抗性，从植物产生工业上有用的化合物和/或材料，和/或生产药物。将克隆的基因引入到植物细胞中并回收稳定可育的转基因植物，可用于制造在多个世代中稳定的植物遗传修饰，借此实现对作物的遗传工程化。

在用于遗传转化和产生转基因植物的方法中，通常将外源DNA随机引入到真核植物细胞的细胞核或质体DNA中，随后分离含有被整合的外源DNA的细胞，然后再生被稳定转化的植物。转基因植物通常通过土壤杆菌介导的转化技术产生。这些技术的成功刺激了其他用于将感兴趣核酸分子引入到植物基因组内的方法的发展，例如PEG介导的原生质体DNA摄取，基因枪(微粒轰击)，和晶须硅介导的转化。

然而，在所有这些植物转化方法中，引入到植物基因组中的外源核酸被随机整合到植物细胞的基因组中，并且拷贝数可不预测。Terada et al.(2002)Nat Biotechnol 20(10):1030；Terada et al.(2007)Plant Physiol 144(2):846；D'Halluin et al.(2008)Plant Biotechnology J.6(1):93。例如，转基因经常以重复序列的形式被整合，或者是整个转基因或是其部分。这种复杂的整合模式通常会对整合核酸的表达水平具有不利的影响(例如，由于转录后基因沉默机制破坏转录的RNA，或者由于诱导整合DNA的甲基化)。同时，整合位点的位置通常也会影响被整合核酸的表达水平。而且，外源DNA的整合可能对发生整合的基因组区域产生破坏性影响，由此影响或干扰靶区域的正常功能，从而产生不良的副作用。上述因素的组合导致转基因或外源DNA的表达水平(和整体农艺品质)在不同的转基因植物细胞和植物系之间发生很大的变异，即便是它们是通过相同方法创建的。因为整合是随机的，所以在从业者试图产生具有期望特征的新植物时，这些影响不能够人为控制。

上述考虑因素致使人们无论在任何时候研究将特定的外源核酸引入到植物中的效应时，都必须产生和分析大量的转基因植物品系以获得显著的结果。类似地，在产生含有特定整合核酸的转基因植物以提供具有期望表型的转基因植物时，必须创建独立创建的转基因植物品系的大群体，以便选择具有最佳核酸表达并对转基因植物的整体表型和性能具有最小或者没有副作用的植物品系。在通过插入多个外源核酸(即，基因堆叠)创建转基因植物时，这些实际的考虑因素具有更大的重要性。在这样的植物中，转录后基因沉默等现象会增多。