[发明专利]氨基酸衍生物

说明书

本发明涉及用在生物共轭方法中的氨基酸衍生物。

引言

吡咯赖氨酸是天然氨基酸，是真正由琥珀密码子指定的天然氨基酸。它使用了第21氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)，天然进化与所有其他氨基酸和tRNA正交。布莱特(Blight)等人，2004示出，PylRS和其配对物tRNA(tRNApyl)可在大肠杆菌中的琥珀密码子处掺入吡咯赖氨酸。他们还示出，该wt PylRS是天然混杂的，并且可掺入赖氨酸的类似物。

横山(Yokoyama)等人(EP 1911840)证明该PylRS/tRNApyl系统在真核细胞中是正交的，并且示出若干非天然氨基酸(nnAA)掺入到由细菌细胞中的琥珀密码子编码的靶蛋白质中。这些作者还鉴别了pylRS中的关键氨基酸残基，这些关键氨基酸残基形成氨基酸结合口袋，并在优于其他标准氨基酸而选择吡咯赖氨酸方面起作用。在此位点的突变产生使得能够用AzZ-lys识别并氨酰化tRNApyl的突变体(柳泽(Yanagisawa)2008)。

这种正交性延伸到细菌和真核细胞。

PylRS是天然混杂的合成酶，它已经天然进化到排除赖氨酸，但会掺入赖氨酸类似物(不经突变)，包括叠氮化物、炔烃和烯烃(柳泽等人，2008；诺伊曼(Neumann)等人，2008；向井(Mukai)等人，2008；阮(Nguyen)等人，2009)。这种特异性的基础依赖于pylRS结合口袋的氨基酸残基与吡咯赖氨酸的吡咯环之间的疏水相互作用，该吡咯赖氨酸的吡咯环稳定并正确地将氨基酸定位在该合成酶的活性位点处(卡佛兰(卡佛兰)等人，2007)。这个RS/tRNA对已通过瞬时转染引入细菌、酵母和哺乳动物细胞中，并显示对于将多个非天然氨基酸掺入到靶蛋白质中是有效的。

例如，EP 1911840证明将N--boc-赖氨酸掺入到大肠杆菌细胞中的靶蛋白质中。

吡咯赖氨酸类似物(定义为由天然或遗传进化的PylRS识别并且掺入到琥珀密码子位点处的蛋白质中的氨基酸衍生物)已在过去几年被披露并且已由例如，费克内尔(Feckner)等人(费克内尔(Fekner)、李(Li)&陈(Chan)，2010)和刘(Liu)等人综述。已经使用pylRS-tRNApyl系统将具有官能团或翻译后修饰的类似物以位点特异性的方式掺入到蛋白质中。若干研究，参见例如柳泽等人，聚焦于PylRS酶内的突变，以容纳类似物，在这些类似物中N6取代基为该结合口袋吡咯赖氨酸内的芳族环。其他人，例如阮等人(也于WO 2010/139948中)和李(Li)等人(也于WO 2011/044255中)聚焦于不携带庞大N6取代基的吡咯赖氨酸类似物的鉴别，结果获得更简单的类似物，这些更简单的类似物对于合成天然pylRS/tRNApyl对和与之相互作用是简单的。此外，金(Chin)等人开发了两种具有末端炔烃和叠氮化物基团的类似物，该类似物可落实通过铜催化点击化学(CUAAC)用于蛋白质标记。

仍存在开发另外的吡咯赖氨酸类似物的需要。在迄今为止制造的吡咯赖氨酸类似物被局限于从赖氨酸骨架发展的那些的时候，诸位发明人已起始于各种氨基酸结构产生了成功掺入到具有天然pylRS/tRNApyl对的蛋白质中的吡咯赖氨酸类似物。

发明概述：

根据本发明，提供了如此处所述的具有式V和VII的吡咯赖氨酸类似物。

还提供了包含作为非天然氨基酸的一种或多种(例如一种)如此处所述的具有式V和VII的吡咯赖氨酸类似物的突变体蛋白质。

还提供了在每个重链和/或轻链中包含作为非天然氨基酸的一种或多种(例如一种)如此处所述的具有式V和VII的吡咯赖氨酸类似物的抗体。

还提供了如前述的突变体蛋白质或抗体，该突变体蛋白质或抗体通过该一种或多种(例如一种)非天然氨基酸共轭至选自以下各项的一个或多个(例如一个)部分：蛋白质、细胞毒素剂、药物和聚合物。

还提供了如前述的吡咯赖氨酸类似物在制造包含一个或多个非天然氨基酸的突变体蛋白质例如抗体中的用途。

本发明中描述的氨基酸类似物是新的并且有用的，并且具有以下优点：制备简单明了、易于掺入到蛋白质中(典型地在适当使用时不损失生物活性)以及为生物共轭提供有用的手段。

附图简要说明