[发明专利]含有适合用于缺血性疾病治疗的细胞的细胞群体的体外增殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及增殖和/或修饰含有来自无血清培养下的单核细胞级分的血管内皮祖细胞（vascularendothelialprogenitorcell）的细胞群体的方法（所述细胞适合用于缺血性疾病的治疗），通过所述方法获得的细胞群体，用于缺血性疾病的含有所述细胞群体的治疗剂的生产方法，等。

背景领域

针对缺血性心脏病，在近年已经应用了骨髓单核细胞移植治疗和通过收集外周血干细胞使用内皮祖细胞（EPC）的细胞移植治疗。因此，已经特别地期望用于培养大量EPC的技术的出现。通过本发明人开发的来自CD34和/或CD133阳性细胞的血管内皮祖细胞的体外增殖方法已经使得提供EPC的有效培养技术成为可能（专利文件1）。由本发明人发明的分析血管内皮细胞的分化中的动力学的方法已经阐明了内皮细胞样大型集落（分化的EPC集落）形成细胞和内皮细胞样小型集落（未分化的EPC集落）形成细胞的存在，其已经使得能够预测和理解细胞移植的治疗效果（专利文件2）。此外，本发明人已经展示了从骨髓单核细胞有效增殖CD34和/或CD133阳性细胞的方法（专利文件3）。

在另一个方面，已经报道了EPC的血管再生能力通过EPC和称为血管生成T细胞并存在于CD34阴性细胞群体中的CD3阳性-CD31阳性细胞的共培养而提高，并且暗示了所述CD34阴性细胞群体含有提高EPC能力的细胞（非专利文件1）。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1:WO2006/090882

专利文件2:WO2006/090886

专利文件3:WO2006/093172

[非专利文件]

非专利文件1:Circulation2007,116:1671-1682。

发明概述

通过本发明解决的问题

如上文提及的文件中显示的，本发明人发展了新的EPC培养技术，但是其中的EPC制备步骤仍需要时间和成本因为CD34和/或CD133阳性细胞需要从外周血等分选。此外，如在上文提及的非专利文件1中，能够提高EPC的能力的细胞可以存在于CD34阴性细胞群体中。因此，如在上文提及的专利文件3中，研究了在没有分选CD34和/或CD133阳性细胞以获得EPC级分的情况下，或通过在给定比例混合CD34阳性细胞和CD34阴性细胞的情况下用于培养单核细胞的条件。结果，其证实了，认为具有分化至血管内皮细胞的高潜力的分化的（大类型）EPC集落形成细胞通过本发明的方法有效增殖，并且令人惊讶地，在血管发生作用以及组织可修复性中，通过所述方法获得的培养或细胞群体优于通过培养CD34和/或CD133阳性细胞获得的培养或细胞群体，因为它们具有炎症抑制作用连同优异的血管内皮形成性，并且对缺血性疾病的治疗有效。

因此，本发明的问题是简化用于缺血性疾病治疗的细胞群体的制备步骤，和提供显示更多治疗效果的细胞群体。更具体地，所述问题是通过在骨髓、脐带血和外周血的收集后的细胞分选的简化，提供用于细胞群体增殖的方法，所述细胞群体不但包括血管再形成细胞：特别地，具有高血管生成能力的分化的EPC集落形成细胞，还包括抗炎性/免疫耐受诱导细胞：特别地，转化为抗炎性的M2巨噬细胞、T淋巴细胞亚群体、调节T细胞。

解决问题的方法

鉴于上文提及的问题，本发明人研究了能够实现在不进行体外单核细胞分选的情况下，或通过混合CD34-分选的、未分选的细胞的，使这些细胞分化/增殖成有利于血管生成的细胞群体的培养条件。结果，他们通过在含有选自（1）干细胞因子（SCF）、（2）白介素-6（IL-6）、（3）FMS-样酪氨酸激酶3配体（FL）和（4）血小板生成素和（5）血管内皮生长因子（VEGF）的因子的无血清培养基中培养单核细胞，已经成功地在体外进行了含有EPC的细胞群体的有效的增殖。含有EPC的细胞群体的特征在于其特别地含有EPC和抗炎性M2巨噬细胞，并且还含有抗炎性T淋巴细胞亚群体和调节T细胞。因此，已经阐明该细胞群体不但显示血管发生，还具有抗炎作用。此外，本发明人已经阐明具有相似功能的细胞群体还可以在从不但是健康的个体还可以是糖尿病患者收集的细胞群体中获得。

特别地在用于培养的单核细胞中，其已经阐明当CD34阳性细胞和阴性细胞在给定的比例培养时，可以得到显示出明显地高血管再生能力的细胞群体。

因此，本发明提供了以下：