[发明专利]组合物及使用方法

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2012年12月7日提交的国际专利申请PCT/CN2012/086179的优先权，将该国际专利申请以引用方式全文并入本文。

技术领域

本组合物和方法涉及源自褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的β-甘露聚糖酶、编码β-甘露聚糖酶的多核苷酸以及它们的生产和使用方法。含有重组β-甘露聚糖酶的制剂具有广泛的用途，例如用于水解某些软木类型的木质纤维素材料和/或包含半乳葡甘露聚糖(GGM)和/或葡甘露聚糖(GM)的木质纤维素生物质底物。

背景技术

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可被多种产生能够将聚合物底物水解成单体糖类的胞外酶的微生物(例如，细菌、酵母和真菌)降解和用作能源(Aro等人，(2001)，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，276:24309-24314)。因为非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，(2001)，Bioresource Tech.(《生物资源技术》)，77:193-196)。通过生物过程有效利用纤维素是克服食品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，(1997)，Biotechnol.Gen.Engineer Rev.(《生物技术和遗传工程评论》)，14:365-414)。

木质纤维素生物质材料的酶促水解大多集中于纤维素酶，其为水解纤维素(包含β-1,4-葡聚糖或βD-葡糖苷键)而导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。传统上将纤维素酶分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶([β]-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC 3.2.1.21)(“BG”)(Knowles等人，(1987)，TIBTECH，5:255-261；以及Schulein，(1988)，Methods Enzymol.(《酶学方法》)，160:234-243)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila，1995年，Mycota(《菌界》)，303-319)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在是结晶纤维素有效溶解所必需的(Suurnakki等人，(2000)，Cellulose(《纤维素》)，7:189-209)。β-葡糖苷酶起到从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡糖苷释放D-葡萄糖单元的作用(Freer，(1993)，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，268:9337-9342)。

但是，为了从木质纤维素生物质材料获得有用的可发酵糖，木质素通常将首先需要例如通过各种预处理方法进行透化，并且使半纤维素破坏以便纤维素酶接触到纤维素。半纤维素具有复杂的化学结构，它们的主链由甘露聚糖、木聚糖和半乳聚糖组成。甘露聚糖类型的多糖存在于多种植物和植物组织中，例如存在于植物的种子、根、鳞茎和块茎中。这类糖可包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖，并且它们通常含有直链β-1,4-连接的甘露糖单元和/或半乳糖单元构成的直链和散布链(interspersed chain)。大多数类型的甘露聚糖不溶于水中，从而形成某些植物组织(如棕榈仁和象牙椰子)的硬度特性。另一方面，半乳甘露聚糖往往可溶于水中，并且存在于豆科植物的种子胚乳中且据信有助于保持这些种子中的水。

复杂的木质纤维素结构和相当顽拗的植物细胞壁的酶促水解涉及许多不同的内切酶和外切酶(例如纤维素酶和半纤维素酶)的协同和/或相续的作用。β-木聚糖酶和β-甘露聚糖酶是内切酶，而β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶是外切酶。为破坏半纤维素，可将木聚糖酶与其他辅助蛋白(其非限制性例子包括L-α-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡萄糖醛酸酶和β-木糖苷酶)一起应用。

内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链中的β-1,4-甘露糖苷键的随机水解，释放出短链和长链寡甘露糖苷。短链寡甘露糖苷可包括甘露二糖和甘露三糖，不过有时候也可包括一些甘露糖。这些短链寡甘露糖苷可被β-甘露糖苷酶(E.C.3.2.1.25)进一步水解。另外，杂多糖的侧链糖可例如通过α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶和/或通过乙酰甘露聚糖酯酶进一步水解至完全。Puls J.，(1997)，Macromol.Symp.(《大分子评论集》)120：183-196。