[发明专利]新的细胞特异性活性核苷酸分子及其应用试剂盒

说明书

本发明涉及新的基于核苷酸的生物活性分子，通过其可以通过靶向方式在特定细胞中诱导或降低基因表达，本发明还涉及应用试剂盒。

通过将核酸导入细胞中，可以实现基因或基因区段、蛋白质或蛋白质片段的产生，其在插入的DNA序列上编码，以及较短或较长的肽的产生；或者，在插入干扰RNA分子的情况中，可以抑制与该RNA互补的特定基因区段的表达。基因表达的抑制可以例如通过插入siRNA(短干扰RNA)或miRNA(microRNA)而实现。典型地，在激活时，siRNA分子可以与靶基因的mRNA相互作用，及与特异性内切核糖核酸酶组合形成称作“RISC”的RNA蛋白质复合物(RNA诱导的沉默复合物)。RISC复合物结合靶mRNA，其中内切核酸酶切割靶mRNA。以此方式，基因表达被阻止，及因此靶蛋白质的形成被抑制。

已经描述了通过在真核细胞中导入特异于靶基因mRNA的序列区段的短的(19-23bp)双链RNA分子(siRNA)抑制基因表达(ElbashirSMetal.:Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells,Nature,2001,May24,411(6836),494-8；LiuYetal.:Efficientandisoform-selectiveinhibitionofcellulargeneexpressionbypeptidenucleicacids,Biochemistry,2004Feb24,43(7),1921-7；US5,898,031A；US7,056,704B2)。

这种分子的使用不阻止基因的转录及mRNA的产生，但是siRNA启动降解靶mRNA的细胞机制。最终，如上所述，特定蛋白质的产生被抑制，而不干扰其它基因的表达(转录后基因沉默)。

目前，siRNA的应用通常针对特定抑制细胞中一个单一基因的表达。因此，同时或以非特异性方式沉默几个基因的作用不是需要的，因此以这些作用被抑制的方式设计mRNA的序列。

本领域也揭示了针对在体内用siRNA增加靶组织的转染细胞的方法(Ikedaetal.:“Ligand-TargetedDeliveryofTherapeuticsiRNA”,PharmaceuticalResearch,Vol.23,No.8,August2006)或者通过结合以细胞特异性方式裂解的短肽实现细胞特异性的方法(WO2008/098569A2)。通过使用所述修饰的siRNA分子，可以选择性降低或抑制特定细胞中基因的表达。

然而，核酸靶向作用的这些方法通常限于短核酸序列；较长的序列存在分子不稳定的问题，因此不能通过靶向输送有效地插入细胞中；已知的在较长核酸末端的短肽结合及其细胞特异性裂解通常不导致希望的细胞特异性作用，因为长RNA或DNA序列末端的肽结合不导致足够的失活。

本发明的潜在问题是修饰长核酸分子，由此其生物学功能通过化学修饰被可靠地失活以及也可以细胞特异性地完全再激活。

根据本发明，一些肽或聚合物结合核酸分子，由此其空间结构被彻底修饰，以便其生物学功能不再有保证或者通常与核酸退火的分子可不再接近该核酸。

本发明的问题通过将长度超过21个碱基的单链或双链核苷酸分子插入细胞中而解决，特征在于为了失活，将核苷酸分子与至少一个肽或聚合物结合，所述肽或聚合物抑制分子的生物学活性及可以由酶裂解，及因此所述生物学活性可再激活。在一个实施方案中，为了抑制核苷酸分子，至少一个肽或聚合物可以结合在核苷酸末端之间。在另一个实施方案中，为了抑制核苷酸分子，至少一个肽或聚合物可以与核苷酸主链结合，由此两个末端彼此结合。在再一个实施方案中，提供了这样的构建体，其中为了抑制核苷酸分子，至少一个肽结合在核苷酸的末端之间，及此外至少一个肽或聚合物与核苷酸的主链结合，由此两个末端彼此结合。

在上文的含义内，本发明本质上特别基于长核酸分子，其被设计为其生物学功能通过化学修饰被可靠地失活，及也可以细胞特异性地完全再激活。在本发明中，术语“长核苷酸分子”或者“长核酸分子”不仅包含长度超过21个碱基的分子。特别地，也包含长度超过23个碱基的核苷酸分子或核酸分子。优选长度超过25个碱基的核苷酸分子或核酸分子。在进一步优选的实施方案中，本发明所述长核酸分子通过化学修饰被修饰，由此其生物学功能被可靠地失活及也可以细胞特异性地被完全再激活，其中所述核酸分子或核苷酸分子的长度超过30、40、50或更多个碱基。