[发明专利]胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用途

说明书

发明背景

本发明涉及新的羟化酶、编码它的核酸序列、包含此序列的表达构建体和载体、用其转化的微生物、用于类异戊二烯的微生物羟化的方法，例如，用于将β-胡萝卜素转变成β-隐黄素或玉米黄质以及将角黄素转变成虾青素的方法。

类胡萝卜素是颜色在黄色至红色范围内的有机色素，其由一些生物包括光合生物(例如，植物、藻类、蓝藻)和一些真菌天然产生。

类胡萝卜素如叶黄素、玉米黄质或虾青素是在人和牲畜饮食中作为色素物质和维生素A衍生物的前体的非常重要的添加剂。此外，类胡萝卜素具有促进健康的作用如增强免疫应答，而且由于其抗氧化剂特性的原因具有预防癌症的作用，这使其用作感兴趣的保健品(nutraceutical)。因此用于制备类胡萝卜素的经济方法和具有增加的类胡萝卜素含量的食品至关重要。用于制备类胡萝卜素的特别经济的方法是生物技术方法，其利用来自产生类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成的生物合成基因和蛋白。

经由β-隐黄素催化β-胡萝卜素酶法转变成玉米黄质的原核β-胡萝卜素羟化酶和编码这些蛋白的基因已知来自噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)(Misawa等,J.ofBacteriology1990,6704-6712；EP393690B1)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)(WO9113078)、橙黄土壤杆菌(Agrobacteriumaurantiacum)(Misawa等,J.ofBacteriology1995,6575-6584；EP735137A1)、产碱菌属菌种(Alcaligenessp.)PC-1(EP735137A1)、黄杆菌属菌种(Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes等,Gene1997,185,35-41；EP747483A2)和来自蓝藻集胞藻属(CyanobacteriumSynechocystis)PCC6803(Masamoto等,PlantCellPhysiol.1998,39(5),560-564)。

还已知来自橙黄土壤杆菌、产碱菌属和噬夏孢欧文氏菌的原核β-胡萝卜素羟化酶还能够将角黄素经由金盏花红素(adonirubin)转变成虾青素(Misawa等,J.ofBacteriology1995,6575-6584；Fraser等,J.Biol.Chem.1997,272,6128-6135)。

已知来自真核来源的三种植物β-胡萝卜素羟化酶可催化β-胡萝卜素经由β-隐黄素酶法转变成玉米黄质。相应的cDNA已从拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Cunningham等,J.Biol.Chem.1996,271,24349-24352,WO9736998)和辣椒(CapsicumannuumL.)中分离。

真核来源的基因相对于原核基因具有优势，其在更高等的转基因生物如植物中表达更佳。尽管如此，仍然需要改进和增加类胡萝卜素生产力用于通过将真核核酸并入生物体而制备类胡萝卜素衍生物或具有增加的类胡萝卜素含量的食品的方法。

此外，现有技术中适当的真核β-胡萝卜素羟化酶具有它们仅有窄的底物范围的缺点使得存在不能由羟化酶转变且可对羟化酶发挥抑制效果的代谢产物的积累。

发明概述

本发明的目标之一是改正现有技术的所述缺陷并提供具有改进特性的真核胡萝卜素羟化酶。

发明人发现通过包含氨基酸序列SEQIDNO:2的具有羟化类异戊二烯(例如，β-胡萝卜素或角黄素)酶活性的蛋白可令人惊讶地实现上述目标。

因此，本发明涉及包含氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白或多肽，或源自此序列通过氨基酸的取代、插入或缺失并与序列SEQIDNO:2在氨基酸水平具有至少50％同源性的序列。

特别地，根据本发明的羟化酶如果在所选的或能够产生特定类胡萝卜素(例如玉米黄质或虾青素)的菌株中表达，与未用编码根据本发明的蛋白或多肽的基因转化的菌株相比，可增加这些类胡萝卜素的水平。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，并涉及产生所述多肽的方法。