[发明专利]多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多个不同的核酸靶序列同时扩增的方法，以及一种用于实施所述方法的试剂盒和一种核酸聚合物文库，特别是DNA或RNA文库。本发明还涉及该方法在基因探针检测以及分子克隆中的用途。

背景技术

特异性核酸聚合物的检测是诊断医学和分子生物学研究的一个重要工具。基因探针检测目前例如在鉴别传染性有机体(Organism)例如细菌和病毒、在探测正常基因的表达以及在鉴别突变基因例如癌基因中、在组织移植前的组织分型兼容性中、在法医学中匹配组织或血液样品中、以及在研究来自不同物种的基因的同源性中发挥着作用。

理想情况下，基因探针检测应该是敏感的、特异性的并且易于自动化。对灵敏度(即低检测限)的要求已通过聚合酶链式反应(PCR)以及允许研究人员在分析之前对特异性靶序列进行指数扩增的其他扩增技术的发展而被大大提高。PCR技术为例如US-B-4,683,202中所描述的。

在过去几年中，通过开发新技术的而取得了进展，该新技术有望降低成本并加速新分子诊断的开发。DNA分析仪在序列分析能力上变得日益增强。DNA重测序微阵列(Chee等人，1996；Patil等人，2001)和高通量平行测序仪(Margulies等人，2005；Shendure等人，2005)目前用于低复杂度基因组的全基因组分析到低至单一核苷酸分离。然而，人类基因组仍然太大以至于如不通过特异性序列定向扩增来降低复杂度而无法实现。为了匹配这些仪器的通量，需要更有效的技术来解决扩增瓶颈。对于全基因组测序成本一小部分的人类外显子的全面重测序，靶序列的富集因此成为了关键。最近开发了几种序列捕获方法，例如分子倒置探针技术(Dahl等人，2007；Dahl等人，2005；Porreca等人，2007)；利用微阵列技术的方法(Okou等人，2007；Hodges等人，2007；Albert等人，2007)；利用RNA寡聚捕获探针在溶液中杂交的技术(Gnirke等人，2009)、或者利用小液滴的乳液PCR的微流体技术(Tewhey等人，2009年)。

理论上，目前最有力和最快速的扩增技术是PCR并已被广泛用于分子诊断。为了提高检测通量并能更有效地利用宝贵的DNA样本，通过将许多特异性引物对结合到个体PCR中以进行几个靶标的同时扩增(Chamberlain等人，1988；Shigemori等人，2005)。然而，这是一个与PCR相关的至关重要的问题是当大量的特异性引物对被加入到相同的反应物中时，正确和不正确的扩增子均产生。此外，即使当可避免引物二聚体并且实现特异性扩增时，由于扩增子长度和序列属性(GC含量)而使靶标具有不同的PCR效率。在后来的阶段，在许多扩增子丢失从而有利于高效扩增的扩增子和赝品的情况下，这影响了产品的均匀性。为了优化多重PCR，需要凭经验确定用于每组引物组合的引物、缓冲液dNTP、酶和氯化镁的浓度。这是个耗时的工艺，该工艺需要进行所生产的每个批次的检测。即使经过详尽的优化实验，也不能保证多重PCR成功。

即使在多重化情形下精心设计引物，PCR通常也仅限于10-20次同时反应，之后收率和均匀性由于不相关的扩增产物的累积而降低(2005；Broude等人，2001)。因此，每当需要分析许多基因组序列时，通常进行大量的单独的PCR。因此，多重PCR的主要挑战是要克服两个主要问题：导致非特异性扩增(例如引物二聚体)的引物不相容性以及不同靶标的扩增效率的差异性。

考虑到现有技术水平的方法的缺点，因此本发明待解决的问题是提供一种简单、快速和便宜的用于同时扩增多个不同的核酸靶序列的方法，特别是DNA和/或RNA靶序列。在此方面，所述方法应允许几乎所有靶序列以比传统方法特别是标准PCR更均匀的丰度扩增。本发明提供了一种新颖的多重化技术，解决这两个基本的问题，从而允许在一个单一反应中进行多个靶标的均匀扩增。

发明内容

方法论原则

效率标签PCR