[发明专利]通过在酿酒酵母中的表达产生可分泌抗体的方法

权利要求书

1.通过表达、分泌和将其呈递在酵母细胞的表面上而产生多种抗体、生物活性抗体片段或具有特定特性的抗体结构域的方法，其包括以下步骤：

(a) 提供酵母种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的宿主细胞，其已经用合适质粒的形式的第一和第二核酸分子转染，其中所述第一核酸分子编码融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含细胞表面锚定蛋白、Fc结合结构域和可调节启动子，所述可调节启动子根据培养条件控制所述融合蛋白的表达，并且所述第二核酸分子编码所述抗体群体，所述抗体片段或抗体结构域呈其轻链和重链的形式，并且在永久活性启动子的控制下， 

(b) 通过在培养基中存在具有> 5,000的分子量的聚乙二醇(PEG)的情况下在酵母细胞中同时共表达多种抗体、抗体片段或抗体结构域而表达所述融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子以及融合蛋白以可溶性形式从酵母细胞分泌，

(c) 在所述酵母细胞的表面上呈递多种抗体、抗体片段或抗体结构域，其以非共价形式结合至表达的锚定至细胞表面的融合蛋白的Fc结合结构域，

(d) 根据结合至Fc结合结构域的多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域的期望的不同的表型或结合特性，在结合至融合蛋白或免疫球蛋白分子或其中含有的检测标记的帮助下选择和分离酵母细胞，

(e) 在使得可能不或基本不进一步表达融合蛋白的培养条件下在特定选择的酵母细胞群体中表达多种抗体、生物活性抗体片段或抗体结构域，和

(f) 从培养基分离具有所选表型或结合特性的多种抗体。

2.根据权利要求1的方法，其中所述细胞表面锚定蛋白是a-凝集素或α-凝集素。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述融合蛋白包含aga2p和Fc结合结构域。

4.根据权利要求3的方法，其中所述Fc结合结构域是蛋白A ZZ结构域。

5.根据权利要求4的方法，其中表达且分泌在细胞表面的融合蛋白包含aga2p和蛋白A ZZ结构域，并且结合至结合且呈递在细胞表面的aga1p亚单位。

6.根据权利要求5的方法，其中GAL1启动子用于从ZZ结构域和aga2p表达融合蛋白。

7.根据权利要求5或6的方法，其中GAPDH启动子组成型用于表达抗体、抗体片段或抗体结构域。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中使用PEG8000或更高分子量PEG。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抗体片段或抗体结构域包含Fab片段或VHH结构域。

10.根据权利要求9的方法，其中所述VHH结构域是VHH-Fc融合蛋白。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中使用酵母菌株EBY100。

12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中分开的质粒用于第一和第二核酸分子。

13.根据权利要求12的方法，其中pYD1用作起始质粒。

14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其用于产生用于生成和选择具有所选表型或结合特性的整个抗体、Fab片段或其它生物活性抗体结构域的抗体文库。