[发明专利]模拟原核途径的植物自固氮

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请要求2013年7月25日提交的美国临时申请号61/858,218和2012年12月3日提交的美国临时申请号61/732,490的优先权，所述每个临时申请以其全部内容通过参考并入本文。

技术领域

本公开涉及一种新的转基因植物，所述转基因植物通过靶向或表达细菌的nif(固氮)基因以产生固氮酶的结构蛋白，并通过导入编码与固氮酶的结构蛋白同源的蛋白质的合成DNA序列，来复制光合细菌例如蓝细菌或其他细菌的固氮机制，还涉及产生这样的植物的方法。

背景技术

植物是属于植物界的活生物体。所有高等植物具有维管组织木质部(主要运输水和矿物质)和韧皮部(主要运输糖类和其他代谢物)。维管植物包括所有具种子的植物(裸子植物和被子植物)和蕨类植物(包括羊齿类植物、石松类植物和木贼类植物)，其也被称为导管植物。它们是具有有组织的细胞结构的真核生物，所述细胞结构包括核(在大多数细胞中)和具有在光合作用期间使用光例如日光作为能源进行碳固定的能力的叶绿体(或其他类型的质体)。其他类型的植物包括例如藻类、苔藓和真菌。

农业作物的作物生产率的总体限制因素是土壤和水中的氮含量。随着农业生产试图与增长的人口的不断增加的需求和减少的可用耕地保持同步，这种元素的供应随时间减少。氮是所有生命形式、包括植物必需的重要营养物之一。然而，氮必须首先被转变成植物可以利用的形式。生物固氮(BNF)现象是使用固氮酶将大气中的氮(N₂)转变成氨(NH₃)。BNF通常由下列化学反应式表示：N₂+8H⁺+8e^-+16ATP>>>2NH₃+H₂+16ADP+16Pi，或者说在8个质子和8个电子存在下并消耗16个ATP分子(三磷酸腺苷——细胞的能量分子)，将氮气分子还原成两个氨分子。由于N₂含有叁键，这个反应消耗大量能量。氮气分子中的键能约为225kcal/mol。在自然界中，很少有BNF作为构成“固氮酶复合体”的植物与几个细菌物种之间的共生关系的结果而进行。固氮酶复合体由两种蛋白构成：Fe蛋白(被称为Nif-H的酶)和Mo-Fe蛋白(被称为Nif-D-K的α和β亚基)。固氮酶复合体由与同二聚体(至少两个相同单元)的Fe(铁辅因子)蛋白暂时结合的异四聚体(不是相同单元)的MoFe(铁-钼辅因子)蛋白构成。

Nif-H基因编码铁蛋白，Nif-D和K基因编码钼铁蛋白。因此，Nif-D和Nif-K基因在它们的最终活性形式中需要Mo和Fe作为辅因子。Nif-D编码Nif-D蛋白，也被称为α亚基，Nif-K编码Nif-K的蛋白被称为β亚基。换句话说，Nif-H是具有两个相同亚基的二聚体酶(总共2个蛋白)，而Nif-D-K是2α2β二聚体(总共4个蛋白)。所有6个亚基对于其功能来说是必需和必要的。在自然界中，Nif-H具有大量变种，并对生物多样性有贡献。存在大量类型的Nif-H这一事实，提供了适应各种不同自然条件的能力。

产生固氮酶复合体的细菌物种包括固氮生物例如蓝细菌、固氮菌科(azotobacteraceae)、根瘤菌(rhizobia)和弗兰克氏菌(frankia)。例如，在蓝细菌中，Mo-Fe蛋白(Nif-D-K)结合大气中的氮(N₂)，然后Fe-蛋白(Nif-H)通过由铁氧化还原蛋白贡献的电子将它还原。铁氧化还原蛋白是在光合作用电子传递链中起到电子载体作用的蛋白质，其类似于高等植物叶绿体的Fe₂S₂铁氧化还原蛋白，但不完全一致。被还原的Fe-蛋白使用ATP将(被还原的)电子传递到Mo-Fe蛋白，后者然后将电子贡献给N₂(固氮酶还原酶)。通过将这个过程重复几次，将N＝N的所有三个共价键还原成2NH₃。