[发明专利]用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化

权利要求书

1.一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：

A)一种成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统嵌合RNA(chiRNA)，其中该chiRNA包含

(a)一种长度为10-30个核苷酸的指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，其中在所述靶序列与所述指导序列的后12个核苷酸之间没有错配，

(b)一种tracr配对序列，和

(c)一种tracrRNA序列

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，和

B)包含两个或更多个核定位序列的II型Cas9蛋白，或者编码所述Cas9蛋白的多核苷酸，

其中该tracr配对序列杂交到该tracrRNA序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracrRNA序列上的tracr配对序列复合的所述II型Cas9蛋白质，

其中所述tracrRNA序列长度为50或更多个核苷酸。

2.一种成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)载体系统，该载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括

I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种编码CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)的核苷酸序列上，其中所述chiRNA包含

(a)长度为10-30个核苷酸的指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，其中在所述靶序列与所述指导序列的后12个核苷酸之间没有错配，

(b)tracr配对序列，和

(c)tracrRNA序列

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，以及

II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码II型Cas9蛋白质的核苷酸序列上，该II型Cas9蛋白质包含两个或更多个核定位序列，该两个或更多个核定位序列具有足够的强度以便在真核细胞的核中驱动该II型Cas9蛋白质以可检测到的量积聚；

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracrRNA序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracrRNA序列上的tracr配对序列复合的所述II型Cas9蛋白质，

其中所述tracrRNA序列长度为50或更多个核苷酸。

3.如权利要求1所述的组合物或如权利要求2所述的载体系统，其中所述Cas9蛋白质是一种引导在该多核苷酸座位的两条链的切割的核酸酶。

4.如权利要求1所述的组合物或如权利要求2所述的载体系统，其中所述Cas9蛋白质是具有D10A突变的化脓链球菌Cas9(SpCas9)蛋白且是切割仅该多核苷酸座位的一条链的切口酶。

5.如权利要求2所述的载体系统，其中编码所述Cas9蛋白质的核苷酸序列是经密码子优化的以表达于真核细胞中。

6.如权利要求2所述的载体系统，其中所述载体是病毒载体。

7.如权利要求6所述的载体系统，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或单纯疱疹病毒载体。

8.如权利要求1所述的组合物或如权利要求2所述的载体系统，其中至少一个NLS在或接近于所述Cas9蛋白质的氨基端和/或至少一个NLS在或接近于所述Cas9蛋白质的羧基端。

9.如权利要求1所述的组合物或如权利要求2所述的载体系统，其中至少一个NLS在或接近于所述Cas9蛋白质的氨基端和至少一个NLS在或接近于所述Cas9蛋白质的羧基端。