[发明专利]对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化

权利要求书

1.一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含

I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到编码CRISPR-Cas系统嵌合RNA(chiRNA)的多核苷酸序列上，其中该chiRNA包含

(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到驻留在真核细胞中的靶序列上，

(b)一种tracr配对序列，和

(c)一种tracr序列，以及

II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码Cas9蛋白的多核苷酸序列上，该Cas9蛋白包含至少一个或多个核定位序列，

其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，

其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的所述Cas9蛋白，并且其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。

2.一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含：

I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至编码crRNA的多核苷酸序列，该crRNA包含

(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到驻留在真核细胞中的靶序列上，和

(b)至少一个或多个tracr配对序列，

II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码Cas9蛋白的多核苷酸序列，该Cas9蛋白包含至少一个核定位序列，以及

III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至编码tracrRNA的多核苷酸序列，该tracrRNA包含tracr序列，

其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，

其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，

其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的所述Cas9蛋白，并且其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中该Cas9蛋白具有一个或多个突变。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中该Cas9蛋白在一个催化结构域中具有一个或多个突变。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中该一个或多个突变是处于该Cas9蛋白的RuvC I、RuvC II、RuvC III或HNH结构域中。

6.根据权利要求4所述的组合物，其中该Cas9蛋白对应于SpCas9的位置编号在位置D10A、E762A、H840A、N854A、N863A或D986A包括一个或多个突变。

7.根据权利要求1或2所述的组合物，其中该Cas9蛋白进一步包括一个功能结构域。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中该功能结构域是一个转录激活剂结构域。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中该转录激活剂结构域是VP64。

10.根据权利要求7所述的组合物，其中该功能结构域是一个转录阻抑物结构域。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中该转录阻抑物结构域是KRAB、SID或SID4X。

12.根据权利要求1或2所述的组合物，其中该Cas9蛋白相比于一种野生型Cas9蛋白是截短的。