[发明专利]核苷酸序列的概率导向分离(PINS)

权利要求书

1.一种富集来自混合多核苷酸样品的靶DNA分子的体外方法，其包含步骤：

a)提供含有所述靶DNA分子的混合多核苷酸样品，其中所述靶DNA分子包含一个或多个至少10个核苷酸的独特连续序列，

b)连续稀释所述混合多核苷酸样品直到在稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，优选低于0.50或甚至更优选低于0.25，和

c)复制足够数量的所述稀释样品直到在复制稀释样品的至少一个中检测所述靶DNA分子的概率为至少0.75，优选0.80～0.95；

d)在所述复制稀释样品中扩增所述DNA以提高所述DNA在每个样品中的丰度；

e)检测所述靶DNA分子在步骤(d)中扩增的所述复制稀释样品中的存在或不存在，其中所述靶DNA分子在所述复制稀释样品中的频率与步骤(a)中的所述混合多核苷酸样品相比得到了提高；

f)连续稀释至少一个含有所述DNA分子的复制稀释样品直到在稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，并且重复步骤(c)至(e)或(f)至少一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)的混合多核苷酸样品中，所述靶DNA分子相对于非靶DNA的频率为10^-2和10^-7之间，优选10^-4和10^-7之间。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中扩增步骤(b)中所述混合多核苷酸样品的连接稀释品以提高所述DNA在每个样品中的丰度，随后为检测所述靶DNA分子在每个扩增的样品中的存在或不存在的步骤，并由此确定为获得在其中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75的稀释样品所需的连续稀释的次数。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中在步骤(b)中通过选自于随机简并引物PCR、接头连接PCR、简并寡核苷酸引物(DOP)PCR和多重置换扩增的技术来扩增所述DNA。

5.根据权利要求1所述的方法，进一步包含步骤i)在所述DNA分子上进行核酸序列分析以确定所述DNA分子的核苷酸序列的至少一部分。

6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中通过PCR检测在所述DNA分子中所述一个或多个至少10个核苷酸的独特连续序列的存在。

7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中通过与所述DNA分子的杂交来检测在所述DNA分子中所述一个或多个至少10个核苷酸的独特连续序列的存在。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA分子包含至少两个至少10个核苷酸的独特连续序列，并且其中所述DNA分子包含50～100,000个核酸碱基对，优选150～3,000个核酸碱基对，更优选150～1500个核酸碱基对。

9.根据权利要求1～12任一项所述的方法，其中对于每次重复步骤(b)～(f)，步骤(f)的稀释样品的总稀释度提高2～20倍。

10.根据权利要求1～13任一项所述的方法，其中在步骤(c)中制备的复制稀释样品的数量为2～500。

11.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述靶DNA分子来源于细胞的基因组。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞选自于细菌细胞、真菌细胞、和哺乳动物细胞。

13.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述靶DNA分子来源于病毒基因组或哺乳动物基因组或它们的组合。