[发明专利]通过丙酮酸和琥珀酸半醛羟醛缩合生产7-碳化学物的方法

说明书

技术领域

本申请涉及使用一种或多种分离的酶例如醛缩酶、脱氢酶、还原酶、脱水酶、硫酯酶、脱乙酰基酶、N-乙酰转移酶、CoA-转移酶、可逆CoA-连接酶和转氨酶，或使用表达一种或多种这些酶的重组宿主细胞，从丙酮酸和琥珀酸半醛通过羟醛缩合生物合成以下一种或多种物质的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇(下文称为“C7结构单元”)。

发明背景

尼龙是聚酰胺，其有时通过二胺与二羧酸的缩聚合成。类似地，尼龙可通过内酰胺的缩聚生成。一种无处不在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的反应生成。尼龙6通过己内酰胺的开环聚合生成(Anton&Baird,Polyamides Fibers,Encyclopedia of Polymer Science and Technology,2001)。

尼龙7和尼龙7,7代表与尼龙6和尼龙6,6相比具有增值特征的新型聚酰胺。尼龙7是通过7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龙7,7是通过庚二酸和庚二胺的缩聚生成的。不存在生成用于尼龙7和尼龙7,7的单体的经济上可行的石油化学路径。

鉴于没有经济上可行的石油化学单体给料；生物技术提供了一种经由生物催化的备选方法。生物催化是使用生物催化剂(诸如酶)来实施有机化合物的生物化学转化。

生物衍生给料和石油化学给料两者是用于生物催化过程的可行起始材料。

因而，针对此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-氨基庚酸、庚二胺、7-羟基庚酸和1,7-庚二醇(heptanediol)(下文为“C7结构单元”)的方法，其中所述方法是基于生物催化剂的。

然而，无野生型原核生物或真核生物天然过度生成C7结构单元或将其排出至胞外环境。不过，已经报告了庚二酸的代谢。

二羧酸庚二酸作为碳源经由β-氧化被众多细菌和真菌有效转化成中心代谢物。辅酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的β-氧化经由例如与芳香族底物降解有关的途径促进进一步代谢。已经广泛表征了3-氧代庚二酰基-CoA被几种细菌分解代谢成乙酰基-CoA和戊二酰基-CoA(Harwood and Parales,Annual Review of Microbiology,1996,50:553–590)。

最优性原理陈述微生物调节其生物化学网络以支持最大生物量生长。超出宿主生物体中表达异源路径的需要，将碳流量引向充当碳源而非充当生物量生长成分的C7结构单元与最优性原理矛盾。例如，与天然生产者的产量性能相比，将1-丁醇途径从梭菌(Clostridium)物种转移入其它生产菌株中经常下降一个数量级(Shen等,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。

在C7脂肪族主链上形成末端官能团(诸如羧基、胺或羟基基团)前，7碳脂肪族主链前体的有效合成是合成C7结构单元中的重要考虑因素。

发明概述

本申请至少部分地基于以下发现：可构建用于生产七碳链式脂族主链前体的生物化学途径，在所述七碳链式脂族主链前体中可形成一个或两个官能团，即羧基、胺或者羟基，导致以下一种或者多种物质的合成：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、庚二胺和1,7-庚二醇(下文称为“C7结构单元”)。庚二酸和庚二酸盐(酯)，7-羟基庚酸和7-羟基庚酸盐(酯)，7-氨基庚酸和7-氨基庚酸盐(酯)本文中可替换使用，指代以其任意中性或离子化形式的化合物，包括其任意的盐形式。本领域的技术人员应当理解具体的形式将依赖于pH。本文描述的这些途径、代谢工程和培养策略依赖于与厌氧性芳香族底物降解途径如酪氨酸降解成中心代谢物相关的酶。

面对最优性原理，令人惊讶地发现，可将适当的非天然途径、给料、宿主微生物、对宿主的生物化学网络的弱化策略和培养策略组合起来，从而高效地生产一种或多种C7结构单元。

在一些实施方案中，用于转化为一种或多种C7结构单元的C7脂族主链是庚二酰-CoA或庚二酸半醛(也称为6-羧基己酰-CoA)，其可通过琥珀酸半醛和丙酮酸的羟醛缩合形成，接着通过脱水和烯酸还原转化为庚二酸半醛或庚二酰-CoA。见图1。

在一些实施方案中，可以使用硫酯酶、醛脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、或可逆CoA-连接酶或CoA-转移酶酶促形成末端羧基。见图2。

在一些实施方案中，可以使用ω-转氨酶或者脱乙酰基酶酶促形成末端胺基。见图3和图4。