[发明专利]用于测量由于非金属化学污染物导致的环境样品中一般毒性及一般毒性的量的体外测试

权利要求书

1.一种用于评价环境样品的毒性的方法，包括以下步骤：

a)将水性缓冲液与酶碳酸酐酶的水溶液混合；

b)将包含二氧化碳(CO₂)或碳酸氢盐(HCO₃^-)的水溶液 添加至步骤(a)中获得的混合物以开始所述碳酸酐酶酶反应；

c)通过评价步骤(b)中获得的所述混合物随时间的pH变 化测定所述碳酸酐酶的酶活性，所述pH变化是由碳酸酐酶催化的 CO₂的水合反应或HCO₃^-的反向脱水反应的指示物；

d)在其中没有添加碳酸酐酶的水溶液的步骤(a)的所述缓 冲液上重复步骤(b)和(c)的步骤以测量非特异活性；

e)在步骤(a)获得的所述混合物中重复步骤(b)和(c) 的步骤，其中，所述溶液包含已经提前与待评价其毒性的所述环境 样品预培养的碳酸酐酶；

f)计算碳酸酐酶的抑制值(I)作为(i)和(ii)之间的百分比， 其中，(i)是在步骤(e)中测得的碳酸酐酶的所述酶活性与在步 骤(d)中测得的非特异活性之间的差值，以及(ii)是在步骤(c) 中测得的碳酸酐酶的所述酶活性与在步骤(d)中测得的非特异活性 之间的差值。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

将重金属螯合剂进一步添加至在步骤(a)中制备的水性缓冲液 和碳酸酐酶的水溶液的混合物；以及

在步骤(e)之后是步骤(f')，其中，碳酸酐酶的抑制值在螯 合剂(Ichel)的存在下计算为(iii)和(iv)之间的百分比，其中， (iii)是在螯合剂存在下发生的步骤(e)中测得的碳酸酐酶的所述 酶活性与在螯合剂存在下发生的步骤(d)中测得的所述非特异活性 之间的差值以及(iv)是在螯合剂存在下在步骤(c)中测得的所述 碳酸酐酶的所述酶活性与在螯合剂的存在下在步骤(d)中测得的所 述非特异活性之间的差值。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重金属螯合剂选自由EGTA (乙二醇四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、BAPTA(1,2-双(邻- 氨基苯氧基)乙酸)和DTPA(二乙烯三胺五乙酸)组成的组。

4.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，步骤(c)和(e) 中碳酸酐酶的所述酶活性通过测量步骤(b)中获得的所述混合物中 随时间变化的pH的初始速率进行评价。

5.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，所述混合物中 CO₂的浓度是包括在100至200mg/l之间，所述混合物是将步骤(b) 中提及的所述水溶液添加至步骤(a)中制备的所述混合物的结果。

6.根据权利要求1-4中一项或多项所述的方法，其中，所述混合物中 碳酸氢盐的浓度包括在5至15mM之间，所述混合物是将步骤(b) 中提及的所述水溶液添加至步骤(a)中制备的所述混合物的结果。

7.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，所述碳酸酐酶 是人类来源的。

8.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，步骤(a)的所 述水性缓冲液包含浓度包括在3至10mM之间的2-氨基-2-羟甲基- 丙烷-1,3-二醇(Tris)或4-2-羟乙基-1-哌嗪基-乙磺酸(HEPES)。

9.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，包含碳酸酐酶 的所述溶液与步骤(e)中的所述环境样品孵育小于30分钟的时间。

10.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，在包括0℃至 10℃之间的温度下进行步骤(b)、(c)、(d)和(e)。

11.根据前述权利要求中一项或多项所述的方法，其中，随时间的pH 变化的评价通过pH变化的比色指示物电测量地或比色地进行。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，pH变化的所述比色指示物是 中性红(3-氨基-7-二甲基胺基-2-甲基吩嗪氯化氢)。