[发明专利]一种鲤钙蛋白酶抑制蛋白基因克隆及其表达量检测的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因表达量检测领域，尤其涉及一种鲤钙蛋白酶抑制蛋白基因克隆及其表达量检测的方法。

背景技术

在全世界范围内，经济鱼类多达几千种，种类不同，其肌肉有不同的风味或肉质。不同品种之间的遗传差异，导致肌纤维类型的不同，Staun证实肌纤维直径和肌纤维密度等性状主要由遗传因素所决定，遗传力较高。在肌肉组织中钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白的降解，是肌肉蛋白质降解的限速步骤，因此钙蛋白酶系统在肉的嫩化中起着重要作用。钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白质。用不同的方法对牛CAST基因进行SNPs扫描，获得一些不同的多态性位点，发现CAST基因的多态性与牛的嫩度显著相关。有研究者对猪CAST、CAPN1和CAPN3基因的多态性及屠宰后肌肉中钙蛋白酶活性表达与肉质的相关性，结果表明：CAST基因对钙蛋白酶的活化时间和滴水损失有影响。由此可见，CAST与肉质，尤其是嫩度有很大的相关性，可以作为肉质性状评定及改良的候选基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲤钙蛋白酶抑制蛋白基因克隆及其表达量检测的方法，旨在解决影响鲤肌肉嫩度相关候选CAST基因的克隆及其相对表达量的问题。

本发明是这样实现的，一种鲤钙蛋白酶抑制蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)设计多组引物，分别为：

CAST1-F：5’-TCAACACCTGCATCTTCTGC-3’；

CAST1-R：5’-TTGAGCTGGAGACACAAACG-3’；

CAST2-F：5’-CGGATACAGAAAGGAAGACCTG-3’；

CAST2-R：5’-AGTATGTCCATCGCATCATCTG-3’；

CAST3-F：5’-GAACACAGATGATGCGATGG-3’；

CAST3-R：5’-TGATCTGGTGGAAGGGAGTC-3’；

CAST3R1：5’-GTTTGTCCTGCCTCTAAGTCT-3’；

CAST3R2：5’-TTCAGTCTGCCGTCTCTGGCCCCC-3’；

CAST5R1：5’-GGTTGTGATGATGGTAAAGTGC-3’；

CAST5R2：5’-CCTTATCTTTCAGAGGGTCCGT-3’；

所述CAST1-F、CAST1-R、CAST2-F、CAST2-R、CAST3-F和CAST3-R为克隆CAST基因部分编码序列用引物，所述CAST3R1、CAST3R2、CAST5R1以及CAST5R2为克隆CAST基因5’、3’UTR用引物；

(2)以目标生物的RNA为模板，在RT-PCR过程中加入步骤(1)设计的引物进行反转录PCR、电泳，确定CAST基因部分编码序列、CAST基因5’UTR序列以及CAST基因3’UTR序列，并确定目标生物CAST基因完整序列。

本发明进一步提供了一种鲤钙蛋白酶抑制蛋白基因表达量的检测方法，包括以下步骤：

根据所述CAST基因完整序列，设计引物：

CASTY-F：5’-CATCTGTTTGTCCTGCCTCTAAG-3’；

CASTY-R：5’-GATGAGGAACCTTCTGACAACTG-3’；其中，所述CASTY-F以及CASTY-R为CAST基因表达定量用引物；以目标生物的RNA为模板，在RT-PCR过程中加入引物CASTY-F、引物CASTY-R进行反转录PCR、电泳，确定目标生物各组织中鲤钙蛋白酶抑制蛋白基因基因表达情况。