[发明专利]一株巨大芽孢杆菌Z2013513及其生产苯基乳酸的方法

权利要求书

1.一株巨大芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为巨大芽孢杆菌Z2013513（Bacillus megaterium Z2013513），已于2013年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013244。

2.利用权利要求1所述巨大芽孢杆菌Z2013513生产苯基乳酸的方法，其特征在于，经种子培养，扩大培养后，由生长细胞或静息细胞转化生产苯基乳酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，生长细胞生产苯基乳酸的步骤包括：

1）种子培养：将巨大芽孢杆菌Z2013513单菌落接种至LB液体培养基，35-40℃，200rpm活化培养8小时；

2）扩大培养：将上述步骤1)所得种子培养液按10%接种量接入SYD培养基中，35-40℃，摇床200转每分培养4h获得生长细胞；

3）转化生产苯基乳酸

扩大培养4个小时后，分别在之后6个小时里，每小时加0.375mL的流加培养基，转化8小时。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述LB培养基包含：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；

所述SYD培养基包含：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L；

所述的流加培养基为：葡萄糖100g/L，苯丙酮酸钠78g/L，pH7的磷酸缓冲液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述静息细胞生产苯基乳酸的步骤包括：

1）种子培养养：将巨大芽孢杆菌Z2013513单菌落接种至LB液体培养基，35-40℃，200rpm活化培养8小时；

2）扩大培养：将上述步骤1)所得种子培养液按10%接种量接入SYD培养基中，35-40℃，摇床200转每分，培养8小时至细胞生长对数中期，将所得培养液于4℃下，4000rpm离心5min，并用无菌生理盐水洗涤2次收集静息细胞菌体；

3）转化生产苯基乳酸

将上述步骤2）所得菌体转到转化液中，40℃转化4-18小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将步骤2）的菌体悬浮于10 ml转化培养基中并于30℃，200rpm摇床中转化；

在前14小时内，每2小时补加0.5ml 流加培养基，共加入约320 mg苯丙酮酸和350 mg葡萄糖，40℃转化18小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3）的转化方法为分批发酵转化：将步骤2）菌体悬浮于10 mL转化培养基中并于40℃，200rpm摇床中转化若干小时，每2h取样，10000rpm离心10min，取上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，然后用同体积0.05%三氟乙酸水溶液溶解，经适当稀释后采用高效液相色谱（HPLC）法测定苯丙酮酸和苯基乳酸的含量。

8.根据权利要求5、6或7所述的任一方法，其特征在于：

所述LB培养基包含：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L；

所述SYD培养基包含：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L；

所述的转化培养基为：葡萄糖20g/L，苯丙酮酸钠4g/L，pH7的磷酸缓冲液；

所述的流加培养基为：葡萄糖100g/L，苯丙酮酸钠78g/L，pH7的磷酸缓冲液。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括进一步的纯化苯基乳酸：

1）将上述权利要求1-7任一项所得的转化液10000rpm离心10min，弃除沉淀，上清液调PH为2.0；

 2）取上述步骤1）所得上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，后取有机相减压蒸发至干，得到苯基乳酸的粗品；

3）用同体积的0.05%的三氟乙酸水溶液溶解步骤2）所得的苯基乳酸的粗品，经适当稀释后采用高效液相色谱法测定苯基乳酸的含量。