[发明专利]一种地塞米松快速检测试剂盒

说明书

  

技术领域

本发明涉及一种地塞米松快速检测试剂盒,为一种检测动物源性食品中地塞米松的酶联免疫试剂盒。 

  

背景技术

地塞米松（Dexamethasone，DSMS）又名氟美松、氟甲强地松龙、德沙美松，是一种人工合成的肾上腺皮质激素。是糖皮质类激素类抗炎、抗过敏药物，其药理作用主要是抗炎、抗毒、抗过敏、抗风湿，临床使用较广泛。近年来，欧盟认为食用含有雌烯二醇、黄体酮、甲羟孕酮等激素的牛肉可扰乱人体内分泌、生长发育、免疫系统、生殖系统等方面的正常功能，还可能致癌、致畸，因而禁止这类激素在动物中的使用。此外,地塞米松还作为动物生长调节剂,促进动物蛋白质合成和代谢,增加产肉量,曾经被广泛应用作为家畜、家禽、使用。但通过长期的实验室研究发现,地塞米松可以使实验动物发生癌变和基因突变,地塞米松及其残留对人、畜均有明显的毒副作用,使用高剂量的地塞米松可导致肌肉萎缩、生长抑制等副作用。并由此推断,人类长期使用该类药物或长期食用添加该类促生长剂的家畜、家禽、同样也可发生癌变和基因突变。所以此类药物禁止在治疗和饲料中使用。 

我国于2002年在农业部发布的235号公告的《动物性食品中兽药最高残留限量》中,地塞米松在所有食品动物肌肉中不得超过0.75ug/kg肝脏中不得超过2ug/kg因此,为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展,建立准确可靠,灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。 

国内外现已开发出检测地塞米松的酶联免疫试剂盒，但是现在国内生产的试剂盒在准确性、灵敏度、特异性等方面还不能完全达到检测的要求。本试剂盒的开发提高了检测的的灵敏度和准确性，可进行大量样本的检测，缩短了时间为企业降低了成本。本发明由此产生。 

  

发明内容

为解决现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供一种地塞米松快速检测试剂盒，样品前处理过程简单，检测时间短、费用低廉，灵敏度和检测限都大幅度提高且能同时检测大批样品。 

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种地塞米松快速检测试剂盒，所述的试剂盒包含有：

(1)包被地塞米松抗原的酶联板或包被地塞米松特异性抗体的酶联板；(2) 酶标记地塞米松特异性抗体或酶标记地塞米松抗原；(3)地塞米松标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液和(7)浓缩复溶液。

所述包被地塞米松抗原的酶联板或包被地塞米松特异性抗体的酶联板的制备步骤为： 

(1)用包被缓冲液将地塞米松半抗原与载体蛋白偶联物或抗体以0.02-0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

所述的缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%-15%吐温-20℃的去离子水或超纯水；所述的封闭液为含有8%-15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。 

所述的酶标记抗原为采用戊二醛法将标记酶与地塞米松半抗原进行偶联得到。 

所述的地塞米松特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 

所述单克隆抗体制备的步骤为： 

（1）动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，地塞米松半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物免疫剂量为80-100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；

（2）细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5-10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

（3）细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l-5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；