[发明专利]一种用于抑制猪瘟病毒复制的Npro207shRNA及其制备方法

说明书

本申请是“申请日：2012年6月4日、申请号：201210180327.2、名称：一种用于抑制猪瘟病毒复制的RNAi及其制备方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及抑制猪瘟病毒复制的方法，具体说是一种用于抑制猪瘟病毒复制的Npro207shRNA(Npro核蛋白前体，short hairpin RNA即短发夹脱氧核糖核酸)，本发明还包括Npro207shRNA的制备方法。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是世界范围内严重危害养猪业的传染病之一。为了区别于非洲猪瘟，欧洲人称其为“古典猪瘟(Classical swine fever,CSF)”。其病原是猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。CSFV是RNA病毒，属黄病毒科(Flaviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)的成员，与同属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和绵羊边界病病毒(Border disease virus,BDV)在抗原性和结构上关系密切。CSFV是具有囊膜的正链RNA（核糖核酸）病毒，具有感染性。CSFV基因组共编码4种结构蛋白、8种非结构蛋白。结构蛋白编码区占据病毒基因组5′端的1/3，非结构蛋白编码区除Npro编码序列位于基因组5′端外，其余均位于病毒基因组3′端的2/3。一般认为病毒侵染细胞是通过囊膜蛋白与细胞表面受体相互作用形成Infecosome（感染复合体）后进入宿主细胞。然而对CSFV感染细胞的细节尚不甚明了。而传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对猪瘟的暴发和流行，RNAi（核糖核酸干扰）现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展，为猪瘟的防制研究开辟了一个新的探索领域。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过内、外源双链RNA触发的，由19-23bp小分子干扰RNA片段(siRNA)诱导的同源性mRNA（信使RNA）的降解，从而使该基因表达沉默(gene silence)的过程。它是广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默，是生物体在进化过程中，抵御病毒感染及因重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制，同时也是一种真核生物体内的基因调控机制。分子生物学研究的早期，人们对基因的了解都是通过基因突变而获得的。近年来，反向遗传学技术广泛应用于基因功能的研究，使人们对基因功能的研究取得了飞跃式的发展，但该技术在基因重组方面耗时费力。在如今的后基因组时代，RNAi技术以其独特的优势成为分析基因功能的又一种方法，得到了广泛的认同。近年来，许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究，取得了良好进展。例如在抗乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、艾滋病毒（HIV）和脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是目前关于RNAi仍有很多问题亟待解决，例如：进行RNAi的时间和靶位点；哺乳类动物中的干扰素反应；RNAi作用的确切机制；脱靶效应等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用机制的探讨上，以及如何改进运用RNAi的方法来研究基因的功能。本发明注重干扰靶区的选择和shRNA的初步筛选，在细胞水平上考察了所选shRNA对靶基因的干扰作用，并借助慢病毒表达系统，筛选表达shRNA的阳性PK-15细胞克隆，在细胞模型水平有助于阐明抑制FMDV复制的关键靶基因、病原感染过程及病原中该靶基因的生物学功能，并为转基因抗病育种打下坚实基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以控制猪瘟的不足，构建靶向猪瘟病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导稳定整合的RNA干扰技术，本发明还提供该技术的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于抑制猪瘟病毒复制的Npro207shRNA，包含siRNA序列，通过构建shRNA(short hairpin RNA即短发夹脱氧核糖核酸)慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，用获得的慢病毒感染PK-15细胞，筛选出具有抑制猪瘟病毒复制的PK-15细胞克隆。

所述序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2即：

Npro207:5’→3’

SEQ ID NO:1：T CACCGCCCACTATTAGGCTAGTATACGA

               ATATACTAGCCTAATAGTGGGC