[发明专利]确定急性高血压肾损伤时足细胞骨架蛋白及其标志蛋白变化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物化学中的检测方法,特别是涉及一种确定急性高血压肾损伤时足细胞骨架蛋白及其标志蛋白变化的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

高血压肾损伤导致慢性肾脏病（Chronic kidney diseases,CKD）已成为危害公众健康的重要病因之一。蛋白尿是CKD的主要临床表现，也是终末期肾脏病（End stage renal disease,ESRD）独立危险因素。减少蛋白尿可延缓CKD的进展，降低ESRD患病率及死亡率。因此，研究如何防止和减少蛋白尿的发生，对CKD的防治具有重要意义。

目前关于蛋白尿产生机制的研究热点为足细胞损害。足细胞位于肾小球滤过屏障的最外侧，作为分子结构性和电荷选择性屏障，在防止血清蛋白漏出方面发挥着重要的作用。当足细胞遭到损害时，首先出现足突裂孔膜消失、足突融合导致蛋白尿产生，蛋白尿又进一步加重足细胞损伤，导致足细胞从基底膜上剥脱。以往基于遗传性芬兰型肾病综合征及获得性足细胞病如微小病变性肾病、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病、糖尿病肾病等的研究表明足细胞相关蛋白及细胞骨架蛋白的表达及分布变化与足细胞损害密切相关。Nephrin、Podocin、CD2AP位于足细胞裂孔膜，作为跨膜蛋白复合体维持裂孔膜结构和功能完整，并参与足细胞内的信号传导，影响细胞骨架的形态及功能。足细胞间“间隙连接通讯（gap junction intercellular communication,CJIC）的结构蛋白CX43是与裂孔膜蛋白复合体相对立的调节系统，在嘌呤霉素大鼠模型中，CX43表达增加，足细胞融合。Podocalyxin（PCX）是一种带有丰富负电荷的跨膜蛋白，主要分布于足细胞顶部及侧部，其通过NHERF2、Ezrin与细胞骨架蛋白相互作用，维持足细胞形态结构的稳定。α-actinin-4、Synaptopodin及F-actin是细胞骨架的重要组成蛋白，α-actinin-4及Synaptopodin表达异常引起细胞骨架重塑，最终导致足突融合、消失。

信号传导通路在足细胞损伤机制中具有重要作用。近年来研究发现P13K/AKT通路、MAPK通路、TRPC6通路的激活与足细胞损害密切相关。体外足细胞培养研究表明，不同刺激因素通过影响足细胞内信号传导通路，引起Nephrin、Neph1、Podocin及CD2AP表达变化，并且四者直接或间接联系，引起α-actinin-4及Synaptopodin表达改变，使细胞骨架发生重塑，导致足突融合或足细胞凋亡。足细胞内多个信号通路蛋白分子与足细胞相关蛋白形成复杂的“分子网络”，影响足细胞的形态及功能。研究发现PI3K/AKT通路、MAPK通路激活，TGF-β及炎症介质、细胞因子等均可导致GSK-3β的磷酸化。GSK-3β在足细胞胞浆内与β-catenin、APC蛋白及Axin形成降解复合体，是GSK-3β/β-catenin信号通路的核心环节。在阿霉素、嘌呤霉素诱导的足细胞病模型中发现β-catenin核聚集现象，其下游转录因子LEF-1在核内共表达。Wnt/β-catenin通路的激活引起β-catenin在胞浆内聚集，打破了细胞池的动态平衡，使其与转录因子TCF/LEF等结合后向细胞核内转移，与转录因子LEF/TCF等共同作用激活下游Snail等靶基因的转录，导致足细胞损伤产生蛋白尿。GSK-3β/β-catenin信号通路控制着细胞的生长、分化、增殖与凋亡等诸多方面，在氧化应激、机械牵拉应力等作用下激活，导致足细胞损害。

高血压、血液动力学异常和各种代谢因素是足细胞损伤和丢失的重要因素。在大鼠的微小病变肾病模型和膜性肾病模型中，检测到有活性氧系统的激活。氧化应激可通过激活P38/MAPK通路等多条途径，进而导致足细胞损伤。Endlich等对种植在硅脂膜（silicone menbranes）上的体外培养的足细胞施加机械应力，发现足细胞骨架肌动蛋白发生重构。对糖尿病肾病研究发现，肾小球滤过压增加，可增加AngII产生，这是由肾小球滤过压升高时的机械应力诱导的。在这一过程中，AngII的形成是单独由机械应力改变导致的，与ACE无关。急性高血压或急进肾缺血时足细胞发生变形和凋亡，出现蛋白尿。因此，氧化应激、机械应力等原因是足细胞损伤的始动因素，可以产生或加重蛋白尿。

然而，本发明人尚未检索到通过GSK-3β/β-catenin信号途径，探讨急性高血压肾损伤时足细胞骨架蛋白及其标志蛋白的变化规律的公开报道。

发明内容