[发明专利]一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及应用。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是一类主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌产生的次级代谢产物，在我国，黄曲霉毒素主要由黄曲霉产生。黄曲霉毒素具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡，其主要的作用靶标是肝脏，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma）的主要因素之一，最短24周内就能够导致肝脏坏死癌变等，此外还可以引起肾脏和肾上腺的急性病变。因此，有效防控黄曲霉毒素污染，对于保障我国食品安全和维护国家经济利益具有重要意义。

不同黄曲霉菌株在产黄曲霉毒素能力上有很大差异，其中不产毒黄曲霉可以占到0%-80%。最近，利用不产毒黄曲霉来抑制产毒黄曲霉的生长从而控制农产品中黄曲霉毒素的含量在美国、非洲等国家和地区得到了较好的应用。可见，如何鉴定黄曲霉是否产毒是非常重要的。目前，对黄曲霉是否产毒主要是先培养黄曲霉菌株，然后再提取毒素，最后对毒素含量进行检测，非常费时费力。因此，开发一种快速鉴定黄曲霉是否产毒的方法对于筛选不产毒黄曲霉，从而控制农产品中黄曲霉毒素的污染具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物及应用。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的引物对组，具体由如下4个引物对组成：序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1、序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2、序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3，以及序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4。

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉3号染色体内一个70kb左右基因簇上的29个基因参与其合成与调控的。研究表明不产毒黄曲霉主要是由于其毒素合成基因缺失造成的。其中，所述引物对1特异于aflT基因；所述引物对2特异于nor-1基因；所述引物对3特异于aflR基因；所述引物对4特异于hypB基因。

在所述引物对组中，每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用。

含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供所述引物对组的制备方法。

所述引物对组的制备方法，具体可包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。

本发明的还一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。

所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。

所述引物对组，或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素中的应用，或在制备用于鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的再一个目的是提供一种利用所述引物对组，或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素的方法。

该方法具体可包括如下步骤：

（1）从待测黄曲霉菌株中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对组中的4个引物对分别进行PCR扩增，得到4份PCR产物；

（2）根据步骤（1）所得4份PCR产物，按照如下方法确定待测黄曲霉菌株是否产黄曲霉毒素：若所述4份PCR产物中目的DNA片段的数目为3个以下，则所述待测黄曲霉菌株不产黄曲霉毒素，或候选不产黄曲霉毒素；若所述4份PCR产物中目的DNA片段的数目为4个，则所述待测黄曲霉菌株产黄曲霉毒素，或候选产黄曲霉毒素；

所述目的DNA片段为如下任一：利用所述引物对1扩增得到的大小为1141bp的DNA片段；利用所述引物对2扩增得到的大小为977bp的DNA片段；利用所述引物对3扩增得到的大小为629bp的DNA片段；利用所述引物对4扩增得到的大小为422bp的DNA片段。

在步骤（1）中，采用所述4个引物对分别进行PCR扩增时采用的退火温度均为55℃。