[发明专利]检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)又称空肠弯曲杆菌，是引起人急性胃肠炎的最重要的食源性致病菌之一，临床上95%以上的弯曲菌性肠炎都是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌引起。空肠弯曲菌可通过食物链传播给人，污染的禽肉、牛奶和饮用水都是主要的传播途径。喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲菌引起的肠炎中使用最普遍的药，同时也是临床上针对弯曲菌感染的一线治疗药物。耐药空肠弯曲菌的出现导致临床上空肠弯曲菌病病程迁延不愈和治疗失败，极大的威胁人类健康，同时耐药菌株也导致治疗成本增加等问题，造成巨大的经济损失。空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药性是由其DNA促旋酶A亚基的编码基因（gyrA基因）上的喹诺酮耐药决定区(QRDR)的点突变所引起。gyrA的野生型基因如序列表的序列3所示，其读码框（编码序列）为序列3第287至2878位核苷酸所示（2592个核苷酸）。gyrA基因读码框（编码序列）第257位（序列3的第543位）核苷酸由C突变为T（因此又称C257T突变），造成其编码的蛋白质的第86位氨基酸残基由苏氨酸（由aca编码）突变为异亮氨酸（由ata编码），引起空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素表现出高水平耐药（最小抑菌浓度均≥64mg/μL）。因此，gyrA基因读码框的第257位核苷酸被称为257突变位点，又被称为喹诺酮类抗生素耐药突变位点。为了确定待检空肠弯曲菌是否高水平耐受喹诺酮类抗生素，有必要建立一种快速准确的分子生物学检测方法。

目前用于检测空肠弯曲菌耐药的方法主要有传统的药物敏感性试验法和基因型突变检测法。传统的基因型突变检测法主要有聚合酶链式反应-线性探针法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法、错配扩增突变聚合酶链反应法及荧光定量聚合酶链式反应法等方法，上述几种以聚合酶链式反应为基础的基因型突变检测方法成本较高，不适宜对大量样品进行检测，而且仅是定性试验，无法进行点突变基因突变方向判定的定性试验。传统的药物敏感性试验需要进行空肠弯曲菌培养，要求较高的培养条件，需要花费大量的时间，不满足急性传染病紧急疫情防治工作的需要。

高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种新兴技术。高分辨率熔解曲线技术基于有序列变化的基因片段之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快捷、准确率高、可进行批量检测的检测引起高水平耐受喹诺酮类抗生素空肠弯曲菌点突变的方法。

本发明所提供的检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法，是一种快速检测由于核苷酸点突变引起对喹诺酮类抗生素耐药的空肠弯曲杆菌gryA突变位点的分子生物学方法，具体是辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括:以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析，所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株；

所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID No.3的第495-625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495-625位相同；