[发明专利]RNA干扰载体片段、RNA干扰载体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及来源于大豆的和根瘤发育相关的GmNNC1基因的RNA干扰载体及其在培育高固氮能力大豆新品种方面的应用。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其通过根部着生的根瘤可固定空气中的氮气，从而转化为植物可以吸收利用的氨态氮，为大豆生长发育提供了必需的氮素养料。由根瘤这一菌根共生器官介导的共生固氮过程不仅有利于大豆的生长，更极大促进了在减少肥料施入的同时大豆产量的提高。目前，提高固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。

大豆根系结瘤固氮是一个受到多个基因调控的非常复杂的生物学过程，目前越来越多的调控基因被报道。大豆中的FW2.2-like1(Libault et al.,2010)、GS52(Govindarajulu et al.,2009;Tanaka et al.,2011)和CND基因（Libault et al.,2009）均被证明可以调控根瘤的发育过程。2012年，大豆中编码14-3-3蛋白的SGF14c和SGF14l基因被证明在调控大豆的根系结瘤过程具有重要作用（Radwan et al.,2012）。

AP2/ERF家族转录因子是植物中重要的一类转录因子，其被证明可以广泛参与植物各类生理过程，在花器官的发育，开花时间的调控，植物体的时态转换，育性等方面具有重要的调控作用（Chen,2004;Jung et al.,2007;Zhao et al.,2007，Zhu et al.,2009）。目前尚未见到关于AP2/ERF调控豆科根瘤发育的报道。大豆中AP2/ERF基因功能的鉴定将为我们阐明大豆根瘤发育的分子机制提供依据，从而为通过生物固氮提高大豆的固氮效率另辟蹊径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种RNA干扰载体及其培育高结瘤固氮植物的应用，尤其是提供一种培育具有高固氮能力的大豆新品种的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种用于构建RNA干扰载体的基因片段，此基因片段用于构建RNA干扰载体的发夹结构，所述基因片段的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示，此片段作为正义链。

上述基因片段的互补核苷酸序列，即与正义链互补的反义链。

一种用于调控植物结瘤固氮能力的RNA干扰载体，包括骨架载体和发夹结构，所述发夹结构利用权利要求1或2所述的基因片段构建。

作为本发明的一种优选技术方案，所述骨架载体为pTCK303载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述发夹结构的间隔为pTCK303载体上的水稻内含子。

作为本发明的一种优选技术方案，正义链位于pTCK303载体中水稻内含子的上游，反义链位于水稻内含子的下游，整体构成了以水稻内含子为间隔的可形成发夹结构的双链RNA干扰载体。将基因片段插入到pTCK303的限制性内切酶KpnI/Spe I和BamH I/Sac I酶切识别位点之间，得到重组表达载体。

上述RNA干扰载体的用途，用于培育具有高结瘤固氮能力的植物。

上述RNA干扰载体的用途，使RNA干扰载体转化受体植物，沉默受体植物中的对应基因，使受体植物的根组织具有增强的结瘤固氮能力。

上述RNA干扰载体的用途，所述转化受体植物的方法为利用农杆菌介导的毛状根转化法；所述被沉默的基因为SEQ ID NO：1所示的基因。

上述RNA干扰载体的用途，所述受体植物为蝶形花科植物。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：参看下述实施例3，利用本发明构建的RNA干扰载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义。

附图说明

图1为GmNNC1响应短期根瘤菌侵染的表达模式分析，在根瘤菌侵染早期的大豆根中，GmNNC1的表达受到显著抑制，该结果说明GmNNC1基因参与了大豆根系结瘤早期对根瘤菌的响应过程。

图2为GmNNC1响应长期根瘤菌侵染的表达模式分析，在根瘤菌侵染的较长时间，即根瘤发生发育的过程中，GmNNC1基因的表达水平也出现了明显的下调，结果表明，GmNNC1参与调控大豆根系在根瘤菌侵染后的发生发育过程。