[发明专利]一种右旋糖酐酶及其在制备低分子右旋糖酐中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药与酶工程领域，具体地说是一种右旋糖酐酶的制备方法及其在制备低分子右旋糖酐中的应用。 

背景技术

右旋糖酐（dextran）是一种链式葡聚糖，由葡萄糖单元以α-1,6-糖苷键连接而成，同时含有少量α-1,3-糖苷键组成的支链结构。右旋糖酐及其衍生物因具有安全、无毒等多种优点已被广泛应用于医药、工业、食品等多个领域，市场需求十分巨大（全球每年的需求近几百亿美金）。不同分子量的右旋糖酐具有不同的药用价值与生物学功能，重均分子量为20-70kDa的中分子右旋糖酐是临床上使用较多的药用级右旋糖酐，主要用作血浆代用品，治疗出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等；重均分子量为6-8kDa的低分子右旋糖酐是制备右旋糖酐铁的优良材料；重均分子量为3-5kDa的小分子右旋糖酐可进行硫酸化，得到的衍生化产品在医疗中可以用于抗血栓。 

传统工业中，右旋糖酐的生产主要是通过肠膜状明串珠菌发酵结合酸解工序来进行，由于酸水解的随机无序性，得到的产品分子量分布不集中从而影响产品的质量；另外，由于利用盐酸水解需要高温高酸等恶劣条件，能耗高，不利于环保、低碳，并且产品收率有待于提高。右旋糖酐酶能够催化降解高分子右旋糖酐，生产出能够适用于食品、化工、医药等领域的中、低分子量的多糖，酶催化反应条件温和、能耗低，从而能实现低分子量多糖生产工艺的绿色、环保、低碳目标，尤其有利于生物多糖在医药领域中的应用。 

申请公布号CN102676615A的专利文本中描述的是右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶分布加入法制备药用级右旋糖酐，右旋糖酐酶必须在右旋糖酐蔗糖酶反应结束后加入，并且需要控制低的加酶量，反应时间短，为的是使中分子量的药用级右旋糖酐富集。本发明公开一种高酶活的右旋糖酐酶制备方法，并运用该酶在多底物溶液中优先降解大分子右旋糖酐的特性，与市售右旋糖酐蔗糖酶同时加入蔗糖溶液中，制备出系列低分子量的右旋糖酐，为低分子量右旋糖酐的双酶合成提供新的技术支撑。 

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种右旋糖酐酶的制备方法及其在制 备低分子量右旋糖酐中的应用。 

本发明提供一种从土壤中筛选出的高酶活右旋糖酐酶产生菌-棘孢青霉，该菌株保藏名称为：棘孢青霉F1008，保藏单位：中国微生物菌种保藏中心，保藏日期：2013年09月13日，保藏号为CGMCC No.8135；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

本发明运用棘孢青霉F1008发酵培养制得高活性的右旋糖酐酶，其制备步骤包括： 

1）菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将F1008菌株接种在试管斜面上，30-32℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备； 

2）菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，将步骤1）中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上30-32℃，转速220r/min下培养48-72小时作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶； 

3）发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran100kDa1.5g，蛋白胨0.4g，K₂HPO₄·3H₂O0.1g，NaNO₃0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，KCl0.05g，FeSO₄·7H₂O0.001g，pH5.0～5.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2）中的种子液按5%的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上30-32℃，转速220r/min下培养5天得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化； 

4）右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3）中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后再进行硫酸铵盐析以及琼脂糖凝胶柱分离，得到纯的右旋糖酐酶酶液，运用DNS法测定酶活力。