[发明专利]一种海带磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种海带磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶的编码酶基因。特别涉及一种海带（Saccharina japonica）磷酸甘露糖异构和GDP-甘露糖焦磷酸化双功能酶基因的核苷酸序列，及其编码蛋白以及在合成褐藻胶和岩藻多糖的能力和在改良重要经济成分性状中的应用。

背景技术

海带是全世界主要栽培的海洋植物（藻类）种类。作为一种海洋蔬菜，海带具有很高的营养价值，同时，褐藻胶、岩藻多糖（褐藻糖胶）等主要经济成分，可以作为原材料广泛应用于各行各业。褐藻胶的用途广泛，主要应用在食品工业、医药卫生、纺织工业、科学研究等方面。岩藻多糖不仅可以作为金属离子的结合剂和阻吸剂，同时还具有如抗HIV病毒、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等生理功能和功效，是一种重要的药用物质。

克隆产物合成相关基因并验证其功能，揭示基因与产物之间的关系，辅助开展品种改良已成为国际农业育种领域提高经济成分含量的有效途径之一；同时，利用基因工程技术生产活性物质与经济产物已成为现代生物技术产业发展的核心内容。

褐藻胶（Algin）是水溶性的褐藻酸钠、钾等碱金属盐类和水不溶性的褐藻酸（Alginic acid）及其与二价以上金属离子结合的褐藻酸盐类；其基本结构是由α-1,4-L-古洛糖醛酸嵌段（α-L-guluronicacid，G）和β-1,4-D-甘露糖醛酸嵌段（β-D-mannuronic，M）通过β-1-4糖苷键不规则的连接而成的多糖。

岩藻多糖（岩藻多糖硫酸酯，fucoidan或fucan sulfate，FS）是一种主要存在于褐藻细胞壁和一些海洋无脊椎动物中的多糖，由L-岩藻糖和硫酸基团组成，此外还有D-木糖、D-半乳糖或者糖醛酸。

褐藻胶和岩藻多糖的生物来源仅为褐藻纲藻类、海洋无脊椎动物及微生物，如真海带（Saccharina japonica）、马尾藻属（Sargassum）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）、海洋假单胞细菌（Pseudomonas sp.）、铜绿假单胞细菌（Pseudomonas aeruginosa）、Halomonas marina等。

不同生物来源的褐藻胶和岩藻多糖结构上有所不同，但是其合成过程基本是一致的。微生物褐藻胶和岩藻多糖的生物合成途径研究的较为详细，如假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、固氮菌（Azotobacter vinelandii）和γ-变形菌（Gammaproteo bacteria）。假单胞菌中，合成通路由多步反应构成，磷酸甘露糖异构酶（AlgA）、磷酸甘露糖变位酶（AlgC）和GDP-甘露糖脱氢酶（AlgD）负责合成褐藻胶和岩藻多糖的前体物质GDP-甘露糖醛酸（Guanosine diphosphate mannuronic acid，GDP-ManA）。而该合成通路在褐藻中仍然是不明确的。Michel等学者对长囊水云（Ectocarpus siliculosus）基因组数据进行生物信息学分析，重组了长囊水云的褐藻胶和岩藻多糖合成通路。在其基因组数据库中搜索到了与AlgA、AlgC、AlgD和AlgG同源的基因PMI（磷酸甘露糖异构酶，Mannose-6-phosphate isomerase）、PMM（Phosphomannomutase）、GMD（GDP-D-mannose dehydratase）和MC5E（Mannuronan C-5-epimerase）。在细菌等微生物中AlgA是一种双功能酶基因，即PMI的Type2类型，能催化合成反应的第一步和第三步反应，但是学者在长囊水云中只搜索到了单功能酶基因PMI，并没有找到催化第三步反应的酶基因GMP（GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶，GDP-D-mannose pyrophosphorylase，MPG），见图2。

海带等褐藻是褐藻胶和岩藻多糖天然来源，其大生物量和高含量的特点使其一直以来就是褐藻胶和岩藻多糖提取的主要原料。但对于其合成褐藻胶和岩藻多糖的基因通路研究十分薄弱，对于其关键的催化甘露糖-6-磷酸转化为GDP-甘露糖反应的编码酶基因仍属于未知，从而使海带等褐藻植物基于基因克隆的品种改良无法实现。

发明内容