[发明专利]用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于核桃蛋白定性定量检测的夹心ELISA试剂盒及其检测方法，属于食品领域。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的提高，食品安全问题日益凸显。“三聚氰胺事件”更使人们强化了非食品用添加剂的食品安全问题，但食用添加剂的不合法添加形势日趋恶劣，如各种各样蛋白饮品(粉、乳等)中鱼龙混杂的蛋白原料添加，各种各样的调制奶、酸奶、核桃乳、核桃粉、奶粉中添加大豆粉等，牛奶、黄牛奶、山羊奶、马奶等的相互掺假问题，极大的影响了食品消费市场的安全和消费者的消费信心。因此，加强其检验方法的研究迫在眉睫。

目前蛋白质检测方法主要包括：蛋白质电泳技术、液相色谱技术、生物质谱技术、近红外光谱技术、免疫技术等。其中只有ELISA检测法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、经济等优点。国内已有利用大豆蛋白多克隆抗体ELISA方法测定火腿肠大豆蛋白含量，利用提纯牛乳酪蛋白免疫试验动物，获得针对酪蛋白的多克隆抗体，建立了牛奶中牛奶蛋白质含量的ELISA检测方法，具有良好的特异性、敏感性、重复性。我们在之前的工作中已成功建立了一种间接ELISA方法用来对核桃蛋白定量检测及掺假检验，但该方法及提供的试剂盒仍然具有稳定性差、重复性弱等缺点。在此工作基础上，将间接法进行改善，改进成一种双抗夹心ELISA方法，具有良好的重复性、稳定性和特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核桃蛋白定性定量检测的ELISA试剂盒，通过制备两种抗核桃蛋白多克隆抗体，建立了一种夹心ELISA法，为我国食品行业中核桃蛋白定量和掺假问题提供了一种重要的监测手段；该试剂盒包括ELISA酶标板、阳性抗原、酶标二抗、稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；其中ELISA酶标板为一抗包被的ELISA酶标板，一抗为豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗体，酶标二抗为HRP标记的兔抗核桃蛋白多克隆抗体，其它试剂为ELISA试剂盒公知的、市场上有产品销售的组分。

本发明试剂盒可包括如下组分：

（1）        ELISA 96孔酶标板：每个试剂盒装有一块真空包装的ELISA板，该ELISA板由豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗体以体积比1:5000的比例稀释后按常规方法进行包被；ELISA板含有可拆卸ELISA微孔板条，规格为：8孔×12条或8条×12孔；

（2）阳性抗原：核桃蛋白10μL；

（3）酶标二抗：HRP标记的兔抗核桃蛋白多克隆抗体使用液10μL；

（4）底物显色液：0.1‰TMB，10mL；

（5）终止液：2M的硫酸溶液10mL；

（6）洗涤液：0.1M pH7.4 PBST溶液30mL； 

（7）稀释液：含5%脱脂牛奶的PBST 30mL，作为样品、抗体稀释液； 

本发明中利用常规等电点法、透析法、滤膜过滤法制备阳性抗原核桃蛋白，具体操作如下： 

1）按每克磨好的核桃粉添加5~10ml的石油醚的比例，用石油醚对核桃粉进行脱脂2~3次后，自然风干，得脱脂核桃粉；

2）将石油醚脱脂核桃粉溶解于核桃粉质量5~10倍水中，调节溶液pH至10~12，然后在55~60℃水浴搅拌提取1~3h，再调节溶液pH值至6.5~7.5进行沉淀；

3）然后溶液3000r/min离心20min，取上清液放入5Kd透析袋透析24~72h，收集透析袋内溶液，经0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤，滤液即为核桃蛋白抗原溶液，然后测定蛋白浓度，调整至6~10mg/mL，分装，-20℃保存备用。

本发明中所述豚鼠抗核桃蛋白多克隆抗体的制备方法如下： 

1）将纯化的核桃蛋白抗原与弗氏完全佐剂以质量（g）：体积（ml）≥0.0001的比例混合乳化15~60分钟，乳化完全后免疫豚鼠，此为基础免疫；

2）之后分别间隔三周、两周、两周使抗原与弗氏不完全佐剂以质量（g）：体积（ml）≥0.00005的比例混合乳化，进行三次加强免疫；第三次加强免疫前，采集血清2mL，ELISA法检测效价；两周后静脉注射纯抗原，冲刺免疫两次，两次冲刺免疫间间隔一周；

3）最后一次免疫7天后，按公知的血清制备方法采血，置于37℃恒温箱中2h，4℃过夜→4℃10000g离心→收集上清，即得抗核桃蛋白多克隆抗体，分装，于-20℃以下保存备用。

本发明中所述兔抗核桃蛋白多克隆抗体的制备方法如下：