[发明专利]一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法。

背景技术

在植物病害控防研究中，许多基础问题的研究或重要理论问题的研究均离不开人工接种发病这基本手段。植物病害人工发病可以在活体植株上接种，也可在植物离体器官材料上接种。采用活体植株接种发病的研究结果，虽然更能反映寄主-病菌互作的本貌，但在活体上接种，往往需要较多的时间和空间场地，耗费较多的精力和财力，而且在许多情况下，局部条件控制的难度较大；而采用植物离体器官材料接种发病，往往需要较少的时间和空间需求，简单易行，接种发病的局部条件较容易控制，容易提高试验的规模与效率；许多植物病理学问题，采用离体材料接种发病手段进行研究，也能达到研究目的，或者说，采用在离体材料上接种与在活体植株上接种的研究结果是一致的。因此，在稻瘟病、稻纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、大豆锈病、马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、以及瓜类疫病、瓜类霜霉病、多种作物炭疽病等许多重要植物病害研究中，均有采用离体接种方法进行有关研究。

由病原真菌Rhizoctonia solani侵染引起的烟草立枯病是烟草生产的重要病害之一，主要在苗期发病，引起死苗，严重时造成一些田块大量缺苗，近年在烟草成株期也常见发生，特别是一些高产栽培区，往往出现较高的发病率，由于在成株期该病害主要引起烟草植株的茎基部坏死，从而导致整株受害，造成较大的损失，这已成了生产上面临的重要问题。要解决这个问题，仍然有赖于加强烟草立枯病的基础研究，而人工发病又是该病害有关研究的基础手段之一。虽然该病害主要危害烟株茎基部，但发明人发现，立枯病菌也可以侵染烟草上部叶片引起清晰的坏死病斑，这个致病特性可在人工接种发病中加以利用，而至今未发现将烟草立枯病菌能侵染叶片致病的有利特性，在人工发病实践中加以应用并建立配套技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法，主要内容是将较大的烟草叶片，裁切成保留主叶脉的长片条（简称离体叶脉片），利用一套简单的器具接种烟草立枯病菌，导致离体叶脉片组织发病而表现出清晰的症状，人工发病方法的步骤如下：

1.接种用器具准备：接种用的主要器具包括：大方盘、小方盘、玻璃罩、工作面板、支架板和支架片等；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用。

2.烟苗培育：按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用。

3.接种菌丝体的准备：将立枯病菌移植到PSA等普通真菌培养基平板中心，PSA培养基成分为：马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，水1000mL，28℃下培养至长出较大菌落，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作接种体。

4.离体叶脉片的采集处理：用干净剪刀剪取步骤2烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的裁切工具将叶片裁切成保留主叶脉的离体叶脉片备用。

5.在接种器具上放置离体叶脉片：

1）组装接种用器具，方法是：取出步骤1备好的器具，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，将工作面板垫靠在支架板和支架片架成的支架上，使面板形成稳定的倾斜状态。

2）放置离体叶脉片：取步骤4备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹稳；然后往小方盘内注入清水，使水面浸没离体叶脉片的基部。

6.接种病菌：挑取步骤3准备的菌丝块，轻轻贴放于步骤5操作完备的叶脉片上。

7.接种后处置：步骤6操作完备后，取玻璃罩将小方盘以及盘内的工作面板和离体叶脉片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在26～28℃。

接种结果导致叶脉片出现非常清楚的坏死病斑，一般接种后30小时开始出现坏死症状，4～6天后整个叶脉片全部坏死。

本发明的优点是：

1）采用较大的烟草叶片，发病结果病情轻重的差异容易得到体现；而且烟草植株可供利用的叶片数量较多，持续期较长；

2）实际实施仅用叶脉条而非全叶片，有利于在有限的器具空间内接种更多的寄主材料；