[发明专利]一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法

权利要求书

1.一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，其特征在于，在倾斜的培养皿内将烟草离体叶片接种烟草青枯病菌，导致叶片的叶脉组织坏死而表现出清晰的发病症状；

人工发病方法的步骤如下：

1）接种用主要器具准备：用普通培养皿作接种用主要器具，清洁消毒后备用；

2）烟苗培育：按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，直至烟苗叶片长度与步骤1）的培养皿直径相近时，即可使用；

3）接种用细菌液的准备：将烟草青枯病菌移植到NA一般细菌培养基平板上，NA培养基的成分：牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30℃培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水调配成细菌浓度为2.5×10⁸cfu/ml，作接种用细菌液；

4）离体叶片的采集：用干净剪刀，剪取步骤2）烟草植株上的叶片长度与步骤1）的培养皿直径相近的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面后待用；

5）离体叶片的处置：将步骤1）备好的培养皿倾斜放置，打开皿盖，取步骤4）准备的离体叶片展开放入培养皿内，叶片的顶端置于倾斜培养皿的高处，叶片的基端置于培养皿的最低处，并用一段干净灭菌的短玻璃棒将叶片的基端压住，每培养皿放一片叶片；

6）接种病菌：取步骤3）准备的接种用细菌液注入步骤5）的放有离体叶片的培养皿内，使细菌液浸没叶片基部，盖回培养皿盖；

7）接种后处置：将步骤6）的带有叶片和细菌液的培养皿置于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在28～30℃；

接种结果导致叶片出现非常清楚的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，一般接种后2天开始表现症状，4～6天后整个叶片全部坏死。