[发明专利]一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，特别是涉及一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法。

背景技术

朱砂叶螨别名棉红蜘蛛、棉叶螨、红叶螨，在我国分布广泛，华北、华东、华中、华南、东北、云南、甘肃等地区均有发生。可为害的植物有43科146种，主要有豆类、茄子、高粱、辣椒、西瓜、草莓、玉米、葱、苋菜、桑树及杂草等。该螨具有极强的繁殖能力，在适宜的生长环境下产卵量多，世代周期短，短时间里就能迅速形成一定数量的种群，然后在植物叶背及叶脉两侧聚集，以口针刺吸植株汁液，并结成丝网，使受害叶片逐渐褪绿，形成无数白色斑点，对植物组织造成严重的伤害。在田间，朱砂叶螨危害严重时可导致植株叶片完全干枯脱落，甚至成片死亡，造成严重的经济损失。多年来对朱砂叶螨最有效的防治方法就是使用化学药剂。朱砂叶螨具有个体小、世代短、发育快等特点，使其极易产生抗药性，因而防治极为困难。至上世纪八十年代末，朱砂叶螨至少对25种杀虫杀螨剂产生了抗药性，导致许多杀虫杀螨剂的效果显著降低。研究表明，在我国，朱砂叶螨对有机氯、有机磷、有机氮类以及拟除虫菊酯类的多种农药已达到中抗至极高抗水平。

拟除虫菊酯类杀虫剂是一类根据具有杀虫活性的菊花提取物的天然除虫菊素化学结构而仿生出来的合成杀虫剂。由于其具有杀虫活性高、击倒作用强、对非靶标高等动物低毒及在环境中易降解等特点，因而从其被发现至今三十余年来，被广泛的用于农业、林业及卫生害虫防治。在2005年，该类杀虫剂的销售额依然占到世界杀虫剂销售总量的20%。

害虫对拟除虫菊酯杀虫剂(或DDT)产生抗性的主要原因是由于靶标位点(钠离子通道)的突变导致靶标与药剂的结合能力下降引起的，这种突变被命名为kdr突变，由此导致的抗性称为kdr抗性，而害虫kdr抗性一旦产生，将导致所有的拟除虫菊酯类药剂对该害虫防治失效。因此，害虫田间种群kdr抗性的早期预警对于延缓抗药性、延长药剂使用寿命、可持续治理害虫以及保护农产品质量安全意义重大，而发展快速、简便和灵敏的kdr抗性检测技术则可为害虫田间kdr抗性的早期预警提供有力的技术支撑。常规的朱砂叶螨kdr抗性检测的方法主要是通过增效剂结合生物测定的方法，了解害虫是否产生了kdr抗性，以及抗性程度有多高。常规检测方法存在一次所需生物试材多、操作复杂、对害虫田间kdr抗性的基因型组成无法准确探测等缺点，因此目前急需一种快速、简便、灵敏的方法检测田间kdr抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法，用于朱砂叶螨田间kdr抗性的监测与预警。本发明申请人从甲氰菊酯抗性朱砂叶螨钠离子通道氨基酸序列鉴定出一个kdr突变F1538I（已公开报道）。本发明的技术路线是：明确朱砂叶螨钠离子通道氨基酸序列的F1538I突变与其对甲氰菊酯抗药性是否存在相关关系；如果F1538I突变与朱砂叶螨对甲氰菊酯抗药性存在相关关系，则基于该突变位点，研究并提出关于朱砂叶螨kdr抗性的简便、快速和灵敏的分子检测方法。

1、本发明申请人研究发现，朱砂叶螨钠离子通道基因F1538I突变频率与其对甲氰菊酯的抗性水平存在显著的正相关关系。

2010-2011年间，本发明申请人从南方地区田间采集获得7个朱砂叶螨野外种群，分别为：重庆市北碚区、重庆市璧山县、重庆市潼南县、重庆市武隆县、浙江省杭州市、湖北省荆州市、云南省个旧市。对各朱砂叶螨野外种群进行对甲氰菊酯抗性水平的生物测定及kdr突变频率测定。检测结果显示，七个野外品系的F1538I突变频率(13.6%到45%) 随着药膜法测定各种群对甲氰菊酯的LC₅₀的升高而上升，说明朱砂叶螨kdr突变F1538I与其对甲氰菊酯抗性相关。将朱砂叶螨地理种群的kdr突变频率与其对甲氰菊酯抗性水平进行线性回归分析，发现kdr突变频率大小与抗性水平高低呈显著正相关关系（R=0.81525）（图1）。该结果表明，kdr突变频率高低与其对甲氰菊酯抗性水平大小之间存在着正相关关系，揭示出kdr突变F1538I与甲氰菊酯抗性密切相关。

基于二者之间的相关关系，使用本发明提供的kdr突变检测方法，即可测出某一种群的kdr突变频率（随机选取30头以上），将突变频率X带入公式Y=23435X+345.16进行计算，可预测该种群的抗性水平Y值（LC₅₀值）。

2、基于F1538I突变，设计特异引物，提出朱砂叶螨kdr抗性PCR检测方法并验证其可靠性

设计原理与思路：