[发明专利]利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法

权利要求书

1.利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法，其特征在于，具体步骤如下：

A.制备淋巴细胞悬液或外周血单个核细胞；

B.将步骤A所得淋巴细胞悬液或外周血单个核细胞加入同种荧光标记的CD3、CD19、CD11c、Gr-1和NKp46抗体，孵育，PBS洗涤，得洗涤细胞；

C.将步骤B所得洗涤细胞固定、清洗、离心，然后进行打孔，经染色后加入另一种荧光标记的RORγt抗体，避光反应后清洗细胞，离心，得RORγt抗体标记的细胞；

D.将步骤C所得RORγt抗体标记的细胞重悬后，上流式细胞仪进行分选CD3、CD19、CD11c、Gr-1CD、NKp46阴性，RORγt阳性的细胞，得LTi细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，淋巴细胞悬液按如下方法制备，分离淋巴结、扁桃体、脾脏或肝脏组织，用PBS清洗后切割成组织块，放入37℃、不含钙和镁离子、含5mM EDTA的Hanks液中洗涤25分钟，然后离心除去表皮细胞，再加入胶原酶III、DNA酶I和中性蛋白酶在37℃下消化30分钟后用PBS清洗，然后用细胞筛过滤，离心，得到淋巴细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：加入胶原酶III、DNA酶I和中性蛋白酶的量为加入后溶液中胶原酶III、DNA酶I和中性蛋白酶的终浓度分别1.0mg/mL、0.02mg/mL和0.1mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，外周血单个核细胞按如下方法制备，收集浓缩的白细胞，经人淋巴细胞分离液分离，得到外周血单个核细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤B中，所述孵育是在温度为10-28℃条件下孵育15分钟。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤C是将步骤B所得洗涤细胞加入淋巴细胞固定液中固定45分钟；再用洗涤液清洗、离心；然后用淋巴细胞打孔液重悬细胞，避光孵育30分钟，加洗涤液，离心，收集沉淀；加入染色液重悬细胞后用另一种荧光标记的RORγt抗体，在10-28℃条件下避光反应30分钟，加入洗涤液清洗细胞，离心，得RORγt抗体标记的细胞。