[发明专利]用于治疗视网膜疾病的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，尤其涉及用于治疗视网膜疾病的试剂盒。 

背景技术

任何影响视网膜正常功能所造成的眼部疾病被称为视网膜疾病，如视网膜色素变性（RP）、其它遗传性视网膜变性、糖尿病视网膜病（DR）、视网膜血管闭塞、视网膜脱离、视网膜撕裂、年龄相关性黄斑变性（AMD）等。这些疾病都可以影响视觉信息的处理，并明显影响到病人的视功能，严重的则可以导致视盲。其中，湿性和干性年龄相关性黄斑变性是造成发达国家老年人视盲的首要原因，是由视网膜色素上皮细胞（RPE）功能失调引起。此外，RP代表的遗传性视网膜变性，以光感受器细胞和RPE的破坏为主要病变特点、视盲为结局。与中枢神经系统疾病类似,由视网膜或视神经变性疾病引起的视盲，尚无有效治疗手段。然而，近年来伴随干细胞研究的兴起，干细胞移植使视网膜再生及功能重建已成为研究热点。这一策略代表了全新的治疗选择，为盲人重见光明带来了希望，具有广泛的应用前景。干细胞移植治疗分别包括了外源性干细胞移植治疗与内源性干细胞激活治疗两种策略。 

但是，在我们前期分别利用视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜前体干细胞（RPC）的移植研究中，我们首先发现外源性的干细胞在进入新的微环境（niche）中缺乏维持其自我更新的能力，从而在数量上难以达到修复病损视网膜的目的；其次，外源性干细胞的来源、免疫排斥、迁移分化及与宿主细胞整合的不确定性等一直是外源性干细胞治疗中难以解决的问题。这些因素都极大地制约了外源性干细胞移植的临床治疗应用。 

激活内源性干细胞并使之定向分化是视网膜疾病治疗的发展方向。1985年，学者Sarthy发现哺乳动物视网膜损伤后Müller细胞重新进入细胞周期，并且体外也能存活。2003年，Fischer&Reh用NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸受体）特异性损伤视网膜内核层细胞，随后内核层有大量细胞增殖，这些增殖的细胞表达Müller细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）及视网膜祖细胞标记，如bHLH转录因子CASH-1，同源转录因子PAX6和CHX10，表明这些具有祖细胞特性的细胞源于Müller细胞，意即在哺乳动物视网膜的Müller细胞中确实包含了一定数量的干细胞。但是在哺乳动物视网膜中，Müller细胞在正常情况下无法重新进入细胞周期开始逆分化，只有在一些急性损伤的情况下，如：应用NMDA造成小鼠视网膜神经节细胞和无长突细胞死亡、应用MNU造成大鼠视网膜光感受器细胞死亡或是应用激光造成小鼠视网膜急性损伤后，少数视网膜Müller细胞可重新进入细胞周期并逆分化为视网膜前体细胞。此外，我们也对慢性视网膜色素变性（RCS大鼠）病变过程中Müller细胞的逆分化进行了详尽的研究并发现：尽管内源性干细胞可以被激活、逆分化，但是这个过程是一个瞬时即逝的，同样，病变、缺损部位很快被胶质瘢痕所填补。理论上，干/祖细胞可以源源不断的增生，并且在正确信号的刺激下，干/祖细胞可以分化为各种类型的细胞；然而，实际上这种自发的再生根本不足以修复受损视网膜的结构与功能，而是以胶质瘢痕为结局。 

因此，如果希望将内源性干/祖细胞活化的特性应用于临床，必须增强内源性干细胞的活化。研究者发现，多种生长因子或细胞因子，如胰岛素（insulin）、碱性纤维母细胞生长因子（bFGF），胶质源性生长因子（GDNF），或脑源性神经营养因子（BDNF）能刺激Müller细胞重新进入分裂周期和去分化,其中部分细胞分化为无长突细胞,表达无长突细胞特异性标志物钙视网膜蛋白（Calretinin）,NeuN,Prox1和GAD67-GFP等。在我们的前期实验中，我们将BDNF注射进入视网膜下腔或将BDNF与视网膜干细胞联合注入视网膜下腔，结果显示：BDNF不仅可以延长对内源性干细胞的激活时间，而且延长了供体干细胞在宿主的存活时间。 

但是，这类方法的缺点在于:外源性营养性因子的作用是短暂的，若反复视网膜下腔或玻璃体腔内注射，易造成眼内感染，严重的如视网膜感染、脱离等并发症，且挽救的光感受器 是否还有功能，还是个问题。