[发明专利]拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途

说明书

技术领域

本发明涉及的是拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途，属于分子生物学技术领域。

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)隶属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，具有很高的经济价值和营养价值，是中国重要海水养殖品种之一。由于拟穴青蟹具食性广、适应性强、生长速度快、养殖周期短、耐干露时间长、易运输和养殖效益高等优点，深受养殖户喜爱，是渔民主要经济来源之一。

随着养殖强度增大以及日益恶化的养殖环境，拟穴青蟹养殖过程不断受到包括细菌、真菌以及病毒等多种病原体的侵害（王荣智等，2008）。在病原感染早期，作为无脊椎动物的拟穴青蟹只能依赖先天性非特异免疫，识别和清除入侵微生物，维持机体健康（Begum et al，2000）。其中，抗菌肽由于具有光谱抗细菌、抗真菌以及独特的作用机理，在蟹类防御病原微生物入侵方面起着重要作用（Sperstad  et al，2009）。

目前，专家于蟹类不同组织分离鉴定了多种抗菌肽。1988-2000年多位学者相继于招潮蟹（Fiddler crab）中分离出Tachyplesin族抗菌肽，包括Tachyplesin I和TachyplesinII，序列分析表明其C端含甲酰胺基精氨酸，N端含焦谷氨酸，由四个半胱氨酸形成两个二硫键，并且对革兰氏阳性和阴性菌以及寄生虫存在一定抑制性（Nakamura T,et al.1988;Miyata T,et al,1989;Kawano K,et al,1990;Kawabata S,et al,1996;Silva P I,et al,2000）；Schanpp D等（Schnapp D，et al，1996）从岸蟹（Carcinus Maenas）血细胞裂解物中纯化出一种富含脯氨酸分子量为6.5 KDa的抗菌肽，其序列类似哺乳动物抗菌肽Bactenecin-7，并且对革兰氏阳性和阴性细菌都有毒性；2008年Stensv?g 等（Stensv?g K,et al,2008.）于互爱蟹（Hys araneus）血细胞中分离出包含37个氨基酸的抗菌肽-arasin 1，其N端富含脯氨酸和精氨酸，体外表达蛋白具有明显抗菌活性；次年Sperstad 等（Sperstad S V，et al，2009）则从互爱蟹血细胞中纯化出一种分子量为11.7 kDa的抗菌肽-hyastatin，其氨基酸序列包含3种不同区域：N端富含甘氨酸，C端具六个半胱氨酸残基，中间为脯氨酸/精氨酸富集区域，对革兰氏阳性和阴性菌以及酵母具有显著抑制作用；Peng H等从锯缘青蟹（Scylla serrata）精液中分离到分子量为11 kDa的抗菌肽scygonadin，其重组蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抗性，但对酵母和真菌无抗性（Peng et al，2010）；Imjongjirak等和Yue等（Imjongjirak C et al，2009；Yue F et al，2010）分别从拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和中华绒螯蟹（Portunus trituberculatus）血细胞中分离纯化到抗菌肽crustin（CrusSp和PtCrustin），两种抗菌肽均在C端具有包含乳清酸性蛋白（whey acidic protein，WAP）结构的典型保守性半胱氨酸残基，对革兰氏阳性菌具有一定抑制作用。