[发明专利]一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法

权利要求书

1.一种透明质酸酶基因，其特征在于核苷酸序列如（a）或（b）或（c）所示：

（a）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（b）在（a）中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个核苷酸或几个核苷酸且具有透明质酸酶活性的基因；

（c）与（a）中氨基酸序列整体相似度在85%以上，具有透明质酸酶活性的基因。

2.根据权利要求1所述透明质酸酶基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或其保守性变异多肽。

3.含有权利要求1所述透明质酸酶基因的转基因细胞系。

4.一种表达权利要求1所述透明质酸酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母为生产菌株，使用BMGY培养基，甲醇诱导发酵生产透明质酸酶。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述毕赤酵母为GS115。

6.权利要求4所述的方法，其特征在于具体步骤如下：以含有透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887为生产菌株，发酵条件为：将种子培养液按10%的接种量接种到25ml（摇瓶容量250ml）BMGY培养基中，温度为30℃、pH为6.0培养至OD600为4，更换诱导表达培养基，添加1%的甲醇进行诱导，每隔24h补加一次甲醇，诱导表达96h。

7.权利要求4所述的方法，其特征在于所示透明质酸酶的纯化条件为：采用二乙氨乙基纤维素柱（DEAE-ellulose）进行离子交换，分别用pH6.5、6.0的双甘氨肽缓冲液洗脱杂质，再以pH5.6、50mM的乙酸盐缓冲液特异性洗脱目标蛋白。