[发明专利]一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及一个与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用。

背景技术

海湾扇贝原产美国大西洋沿岸及墨西哥湾，有四个地理亚种，其中北方亚种和南方亚种先后引进中国。海湾扇贝北方亚种主要养殖在河北、辽宁和山东沿海（渤海海域），南方亚种主要养殖在广东广西沿海（北部湾海域），是我国重要的养殖贝类。高温年份，海湾扇贝北方亚种主养区经常发生规模死亡，给养殖户造成巨大损失。高温被认为是引起扇贝夏季规模死亡的主要环境诱因，因此提高海湾扇贝热耐受性具有重要的现实意义。

生物通常有三种途径应对环境胁迫：1）分子伴侣蛋白表达上调，帮助细胞内蛋白维持正确的空间结构或错误折叠蛋白的重新折叠；2）细胞抗氧化系统有效平衡胁迫条件下产生的自由基，防止胞内结构被破坏；3）启动泛素蛋白酶体系以降解结构被破坏了的蛋白，防止其聚集产生毒性。宋林生等对海湾扇贝热休克蛋白HSP70启动子区进行重测序鉴定出8个与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记，这些标记可能通过影响HSP70表达水平影响海湾扇贝热耐受性，然而这种可能性尚未被证明。

本发明在利用转录组测序预测海量SNP标记的基础上，利用候选基因关联分析的方法，筛选出1个与海湾扇贝热耐受性极显著相关的SNP标记，发现该SNP的T等位基因比C等位基因更有利于海湾扇贝在高温胁迫条件下存活。荧光定量PCR结果显示，热激情况下海湾扇贝转录本53308转录水平显著上调，据此推测与上述SNP紧密连锁的一种变异通过影响基因的表达影响海湾扇贝的热耐受性。从而，上述SNP可以作为海湾扇贝热耐受性的功能标记，用于海湾扇贝高热耐受性品系的选育。本发明不但提供与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记，还提供简便且具有可移植性的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记及其鉴定方法和潜在应用。

本发明通过以下技术方案得以实现：

一种与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记：所述与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记位于海湾扇贝转录本Ai-53308序列的第760个碱基处，此碱基存在T和C两个形式；

所述海湾扇贝Ai-53308转录本，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

与海湾扇贝热耐受性相关的SNP标记的鉴定方法，包括步骤如下：

1）提取海湾扇贝的基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；

2）取步骤1）中所述海湾扇贝的基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA1uL，通用PCR mix5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL（若基因组DNA浓度≤5ng/uL，可加4.6uL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。另反应体系可同比放大）；

3）PCR扩增的反应程序为：

4）步骤3）所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标（等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5uM）各1uL，经过95℃退火5-10min；

5）待步骤4）所述的退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中所述海湾扇贝SNP标记的基因型，具体方法为：

a）利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b）对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC，若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT，若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC；

c）判断每个待测样本所述海湾扇贝SNP标记基因型。

所述步骤2）中，用于鉴定所述与海湾扇贝热耐受性性状相关的SNP标记的正向引物为F：5’-GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’；

反向引物为R：5’-TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。

SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，

高温内标序列为：

5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

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