[发明专利]一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂。尤其涉及一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virusⅡ,HSVⅡ)是人类病毒性疾病中常见的病原体之一。单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)检测方法有一系列的问题，比如。单纯疱疹病毒虽然易于进行体外细胞培养，并能产生可见的细胞病变，但病毒分离培养由于技术要求高、分离时间长、易污染、设备昂贵，并且需要熟练的技术人员，因此检测价值较低，不利于大量开展。常规PCR检测HSVⅡ-DNA，具有简便、快捷等特点。但是由于扩增后的产物需电泳检测，易造成交叉污染出现假阳性的结果。

荧光定量PCR是(realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。其反应原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

由于HSVⅡ基因组保守区GC含量较高，将荧光定量PCR技术应用于HSVⅡ-DNA检测的关键技术是引物和荧光探针的设计，普通探针设计由于GC含量太高导致探针TM值太高，容易非特异结合，导致假阳性结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有稳定的线性结构的探针，还在于提供一种具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO:4的序列，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团；所述引物的序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列。

所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记DABCYL非荧光淬灭基团。

本发明还提供一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括所述的任一引物和探针。

试剂盒还包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂和参考品试剂。

所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为二氧化硅、Triton X-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述洗涤液为Triton X-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为Triton X-100、EDTA·2Na；所述参考品试剂为HSVⅡ阴性对照、HSVⅡ阳性对照，HSVⅡ强阳性对照和HSVⅡ定量标准品；优选的，优选的，所述裂解液为10mMPH7.01重量‰二氧化硅、1体积‰Triton X-100、10mM EDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.01体积‰Triton X-100、1mM EDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.01体积‰Triton X-100、1mM EDTA·2Na；所述HSVⅡPCR反应管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA·2Na、25微升石蜡油；HSVⅡ反应缓冲液为10pM HSVⅡ引物，5pM HSVⅡ探针、20mMPH9.050mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1mM EDTA·2Na、0.2mM dNtps。

本发明提供一种应用所述引物和探针或所述试剂盒进行单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，

样品制备；制备得到纯化的核酸；

PCR扩增和荧光值读取，采用所述引物和探针或所述试剂盒；

结果判定。