[发明专利]一种肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统及制备方法

权利要求书

1.一种肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统，其特征在于：该给药系统的实现方法主要有：（一）增强肿瘤靶向性；采用靶向分子ACPPs与肿瘤过表达MMPs（主要是MMP2和MMP9）发生酶－底物反应获得肿瘤靶向性，通过ACPPs修饰pHPMA-腺病毒给药系统，使pHPMA-腺病毒给药系统获得肿瘤靶向性；（二）降低腺病毒给药免疫清除效应；将孵育前后的Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7感染A549细胞48h，获得免疫清除少，循环半衰期长，腺病毒的给药量低的反应产物ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp；（三）腺病毒定位于细胞胞浆，有利于治疗基因的表达；通过ACPPs的介导的穿膜方式实现大分子药物跨膜转运效率较高；跨膜转运于20分钟内出现，并随时间不断增强；（四）抗肿瘤谱广；该肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp，采用黑色素瘤分化相关基因-7(mda-7)，实现促进多种癌细胞的生长抑制和凋亡。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统，其特征在于：合成步骤有以下组成：

一、pHPMA（pHPMA-ONp）的合成

①HPMA的合成

将甲基丙烯酰氯100ml(1.01mol)加入到含1-氨基-2-丙醇160ml（2.02mol）的乙腈溶液中，室温搅拌30min；滤去沉淀；然后将滤液保持-50℃，逐渐有白色沉淀产生，放置0.5h，直至沉淀完全析出；过滤后，将沉淀以丙酮重结晶；

②N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸对-硝基苯酯（MA-GG-ONp）的合成

将5.24g甘氨酰甘氨酸（0.04mol）溶于4N的NaOH溶液，加入0.04mol甲基丙烯酰氯及10ml4N的NaOH溶液；室温搅拌2h,酸化至pH2,沉淀以50%乙醇/水重结晶得N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸；取5g（0.025mol）上述结晶后的N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸溶于二甲基甲酰胺，加入5.65g N,N-二环己基碳二胺（简称DCC，0.027mol）及3.8g（0.027mol）对-硝基苯酚(简称ONp),-10℃搅拌3h，室温搅拌8h，过滤除去沉淀，滤液浓缩至一定体积，过滤除去沉淀，加入乙酸乙酯，沉淀以乙醇/乙醚（1：1）重结晶；

③pHPMA的合成

以2，2-偶氮二异丁腈（简称AIBN）为引发剂，HPMA与适量的MA-GG-ONp通过自由基聚合沉淀反应制得一系列聚合物前体（聚合物单体：引发剂：溶剂=12.5:3:84.5wt%）；将AIBN与HPMA溶于丙酮，再与MA-GG-ONp的DMSO溶液混合；混合液置于安瓿中，通氮气后密封，于50℃反应24h；沉淀物溶于甲醇，并于乙醚再沉淀得到纯品，真空干燥得兰色固体粉末；

二、pHPMA-coated（pc）-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及检测

取pHPMA-ONp溶于25μl双蒸水中形成终浓度为10mg/ml溶液；加入含有Ad.mda-7.egfp（10¹⁰vp）的10%甘油/PBS溶液100μl，4℃反应12h形成最终的接合物；反应完成后取5μl产物，与无血清1640培养基培养的A549细胞孵育，同时加入等量Ad.mda-7.egfp及1640培养基作为对照，2h后吸弃上清，PBS冲洗三次，加入含10%血清1640培养基继续培养10h后，倒置荧光显微镜下488nm蓝光激发，观察照相；

三、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及检测

取pHPMA-ONp溶于25ul双蒸水中形成终浓度为10mg/ml溶液；加入含有Ad.mda-7.egfp（10¹⁰vp）的10%甘油/PBS溶液100μl，4℃反应2h后加入终浓度为100ng/ml的ACPPs，于4℃继续反应10h形成最终的接合物；反应完成后取5ul产物，与无血清1640培养基培养的A549细胞孵育，同时加入等量Ad.mda-7.egfp及1640培养基作为对照，2h后吸弃上清，PBS冲洗三次，加入含10%血清1640培养基继续培养10h后，倒置荧光显微镜下488nm蓝光激发，观察照相；

四、动态光散射法（dynamic light scattering，DLS）测量腺病毒及其接合物的粒径

合成pc-Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp两种接合物，合成方法如1.2.2及1.2.3.；反应完成后将两种接合物用S400柱(27-5140-01GE Health care)进行纯化.取纯化后的两种接合物样品（10⁹vp）及Ad.mda-7.egfp（10⁹vp），加入终体积为1000μl的双蒸水中，动态光散射仪(ZetaSizer,Malvern,UK)于659nm波长90度测试角度进行粒径测试；

五、全波长酶标仪检测绿色荧光蛋白表达

A549细胞以10⁴/孔接种96孔板，细胞生长至90%融合时上样，实验分为四组，分别为空白对照组Ad.mda-7.egfp、pc-Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp，三组腺病毒上样量为10⁴vp/细胞；48h后吸弃上清，PBS冲洗三次，以100μl Triton X-100裂解细胞，全波长酶标仪(Multiskan GO,Thermo,FI)于波长λ_ex488nm andλ_em538nm检测绿色荧光蛋白表达，荧光量以相对荧光单位(RFU)计算；

六、流式细胞仪检测接合物感染能力

A549细胞以10⁵/孔接种6孔板，细胞生长至90%融合时上样，实验分为四组，分别为空白对照组加入100μlPBS，Ad.mda-7.egfp组、pc-Ad.mda-7.egfp组及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组，三组腺病毒用碘化丙啶（PI）进行标记15min，上样量为10⁴vp/细胞；12后吸弃上清，PBS冲洗三次,胰酶消化后以1500g/分离心2min，用FACS Calibur^TM流氏细胞仪于λ_ex540nm和λ_em625nm测量各组细胞内PI荧光；

七、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp免疫逃逸能力检测（抗腺病毒抗体中和实验）：

A549细胞以10⁴/孔接种96孔板，含人抗腺病毒抗体（Nab）血清以1：20稀释于PBS液中，于56℃灭活20min，取100μl上述稀释血清分别与Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp孵育20min，加入适量含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释腺病毒）（10⁸vp/100μl），A549细胞以PBS液冲洗后，以Ad.mda-7.egfp感染无血清DMEM培养A549细胞（10⁴vp/细胞）为对照组，实验组分为抗腺病毒抗体组及无抗腺病毒抗体组，以10⁴vp/细胞分别加入孵育前后的Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp，48h后吸弃上清，PBS冲洗三次，以100μl Triton X-100裂解细胞，全波长酶标仪(Multiskan GO,Thermo,FI)于波长λ_ex488nm与λ_em538nm检测绿色荧光蛋白表达，结果为实验组绿色荧光值与对照组绿色荧光值之比；

八、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp肿瘤靶向性检测

HBE,A549,SW480,OVCAR3四种细胞株以10⁴/孔接种96孔板，分别以200μL含10%胎牛血清的DMEM培养基(A549,MDA-MB-231)和200μL含10%胎牛血清的1640培养基(HBE,HepG2)培养24h，以10⁴vp/细胞将ACPPs-pc-Ad.mda-7.Egfp感染四种细胞48h，吸弃上清，PBS冲洗三次，以100μl Triton X-100裂解细胞，全波长酶标仪(Multiskan GO,Thermo,FI)于波长λ_ex488nm与λ_em538nm检测绿色荧光蛋白表达，荧光量以相对荧光单位(RFU)计算；

九、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp接合物的穿膜活性检测

A549细胞以10⁵/孔接种6孔板，细胞生长至50%融合时上样，以染料PI对腺病毒进行标记15min，实验分为两组，pc-Ad.mda-7.egfp组及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组，上样量为10⁴vp/细胞；于37℃5%CO₂培养箱中培养4h后吸弃上清，以染料(5-or6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'–diace-tylfluorescein,CFSE)对细胞染色15min，PBS冲洗三次,加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，Nikon TI-S倒置荧光显微镜下观察照相；

十、ACPPs与pc-Ad.mda-7.egfp的细胞内共定位检测

A549细胞以10⁵/孔接种6孔板并生长至50%融合，将用FITC标记的ACPPs与pHPMA-ONp及PI标记的Ad.mda-7.egfp进行接合反应，方法同1.2.3；反应进行12h后S400柱纯化样品，以10⁴vp/细胞将ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp感染A549细胞4h，于Nikon TI-S倒置荧光显微镜下λ_ex488nm与λ_em538nm检测FITC－ACPPs，λ_ex540nm和λ_em625nm检测pc-Ad.mda-7.egfp(PI),观察照相；

十一、ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp穿膜活性的时间依赖性检测

A549细胞以10⁵/孔接种6孔板并生长至50%融合，ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp及pc-Ad.mda-7.egfp用PI标记15min，分别感染A549细胞20min、2h及4h，PBS冲洗三次,加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，Nikon TI-S倒置荧光显微镜下λ_ex540nm和λ_em625nm观察照相；

十二、Hoechst33342、PI双染法检测ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp诱导A549细胞凋亡

在6孔板中接种肺癌细胞株A549，生长至40%满后，分成3组，对照组1和对照组2分别加入无血清1640，pc-Ad.mda-7.egfp(10⁴vp/cell)，实验组加入ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp(10⁴vp/cell)处理，48小时后，反复PBS洗涤后加入终浓度5ug/ml的Hoechst33342，避光染色10分钟后加入终浓度为15ug/ml PI，避光染色10分钟后，Heochst33342用氪激光激发的紫外线荧光，PI用氩离子激光激发荧光，结果判断：正常细胞为低蓝光/低红光，早期凋亡细胞为高蓝光/低红光，晚期凋亡细胞高蓝光/红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。